楊金 章強(qiáng)強(qiáng)

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科，上海 200040)

無綠藻感染引起的無綠藻病是一種較罕見疾病，自1964年Davies[1]首次報(bào)道1例中型無綠藻 (Protothecazopfii)所致的皮膚無綠藻病以來，全球范圍內(nèi)已有190例文獻(xiàn)報(bào)道，其中近1/3的無綠藻病例在最近10年內(nèi)被報(bào)道，說明無綠藻病發(fā)病率有升高趨勢(shì)。雖然無綠藻作為病原體在人群中發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，然而發(fā)病率的升高可能和免疫功能低下人群的增多有關(guān)[2]。為提高對(duì)無綠藻這一條件致病真菌的認(rèn)識(shí)，以期對(duì)無綠藻病的診治有進(jìn)一步探索，本文對(duì)無綠藻的微生物學(xué)特性和鑒定方法進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

1 分類學(xué)

從1894年Kruger首次分離出無綠藻[3]以來，無綠藻的分類一直受到爭(zhēng)議。最初，根據(jù)在沙氏培養(yǎng)基培養(yǎng)后的酵母樣外觀，無綠藻被歸為真菌，然而無綠藻既不能和酵母也無法和更低級(jí)別的藻類植物聯(lián)系起來。1913年Chodat[4]根據(jù)無綠藻和小球藻相同的無性繁殖生成內(nèi)孢子的繁殖方式，重新將其歸于藻類。1930年Asdforth等[5]從熱帶口炎性腹瀉的病例中分離出Protothecazopfii和P.portoricensisvar.trisporus，并確定這種生物可以在合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。Ciferri[6]在1957年將無綠藻重新歸為酵母菌。目前普遍認(rèn)為，無綠藻在進(jìn)化過程中一定程度上由小球藻發(fā)育而來，同時(shí)在細(xì)胞壁組成、生理學(xué)和抵抗外界環(huán)境壓力的能力有所不同[7-8]。無綠藻細(xì)胞壁含有的孢粉素是一種穩(wěn)定的生物高聚物，使其可以抵抗機(jī)械壓力、物理化學(xué)因素以及酶降解[9]。基于細(xì)胞壁的特征，目前無綠藻在生物學(xué)分類中處于真核生物 (Eukaryota)、綠色植物界 (Viridiplantae)、綠藻門 (Chlorophyta)、Trebouxlophyceae綱、綠藻目 (Chlorellales)、綠藻科 (Chlorellaceae)、無綠藻屬 (Prototheca)[2]。

在過去，只有3種無綠藻被識(shí)別：大型無綠藻 (Protothecastagnora)、中型無綠藻 (Protothecazopfii)和小型無綠藻 (Protothecawickerhamii)[10]。然而從人和動(dòng)物身上分離的幾株菌株測(cè)序核糖體RNA結(jié)果顯示，先前描述的中型無綠藻變種可能是不同的種類。中型無綠藻基因1型通常在牛糞中發(fā)現(xiàn)，然而大多數(shù)牛乳腺炎是由中型無綠藻基因2型導(dǎo)致。從豬糞而非牛糞中分離的中型無綠藻基因3型，被重新命名為Protothecablaschkeae。最近Kazuo等[11]在一位患者感染皮膚上得到的活檢標(biāo)本，通過組織病理和微生物培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)并分離出一種新的無綠藻。通過分子鑒定等技術(shù)確定該菌株和小型無綠藻和小球藻有較近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，是無綠藻屬的新種類，提出Protothecacutissp.nov。目前，普遍認(rèn)為無綠藻屬包括6個(gè)種：大型無綠藻 (Protothecastagnora)、中型無綠藻 (Protothecazopfii)、小型無綠藻 (Protothecawickerhamii)、Protothecaulmea、Protothecablaschkeae及Protothecacutis[12]。

2 流行病學(xué)

無綠藻廣泛存在于自然界，通常能從植物表面、土壤或者水源中分離出，也可能暫時(shí)以菌落的形式存在于人或動(dòng)物的消化道，有時(shí)定植在人體皮膚和甲床而無臨床表現(xiàn)。然而因?yàn)闊o綠藻的腐生性質(zhì)，它們更傾向于污水、牲畜糞液等潮濕環(huán)境來持續(xù)獲得可供降解的有機(jī)物[10]。

無綠藻導(dǎo)致的無綠藻病是一種罕見、散發(fā)疾病。人、犬、貓及非家養(yǎng)哺乳動(dòng)物均可能感染[13]。人類無綠藻的感染較多由小型無綠藻導(dǎo)致[14-15]，中型無綠藻感染的病例也有報(bào)道[15]，最近發(fā)現(xiàn)的P.cutis也能引起人感染造成皮膚損害[11]。其他幾種無綠藻主要導(dǎo)致動(dòng)物感染，如牛乳腺炎。具體菌種致病性及臨床表現(xiàn)見表1。

表1 無綠藻與疾病表現(xiàn)

注：C.皮膚,M.乳腺炎,O.鷹嘴滑膜炎,S.系統(tǒng)感染

3 真菌形態(tài)與結(jié)構(gòu)特征

無綠藻與酵母菌外形相似，呈球形、橢圓形甚至腎型，是直徑3～30 μm不等的單細(xì)胞微生物。無綠藻不含細(xì)菌特有的胞壁酸及真菌特有的葡糖胺[16-17]，缺乏葉綠體，電鏡下觀察可見細(xì)胞壁僅兩層。無綠藻進(jìn)行無性繁殖，孢子囊是無綠藻屬的主要結(jié)構(gòu)，大約2～20個(gè)內(nèi)生孢子從一個(gè)孢子囊中逐漸發(fā)育長(zhǎng)大并隨著孢子囊的破裂被動(dòng)釋放出來[18]。不同種類無綠藻的孢子囊直徑不同[19]，大型無綠藻孢子囊直徑7～14 μm，中型無綠藻7～30 μm，小型無綠藻3～10 μm。小型無綠藻的孢子囊為桑葚狀，有多分隔結(jié)構(gòu)，內(nèi)孢子呈對(duì)稱排列。其他類型無綠藻不形成多分隔結(jié)構(gòu)，而是表現(xiàn)為隨意的不規(guī)則分隔[2]。無綠藻培養(yǎng)適溫在25～30℃之間，需氧或微需氧[20]。一般菌落形態(tài)為潮濕、灰白色乳酪樣，鏡下結(jié)構(gòu)呈圓形或橢圓形孢子，壁厚、無菌絲及芽孢，內(nèi)含特征性內(nèi)孢子。

4 藥物敏感性

無綠藻體外藥敏實(shí)驗(yàn)，至今尚無美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所 (CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控及MIC折點(diǎn)，因此只能從已經(jīng)發(fā)表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)中總結(jié)無綠藻菌對(duì)不同種類藥物的敏感性。

體外藥敏實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)無綠藻屬對(duì)兩性霉素B敏感[21-24]，這一結(jié)果也與臨床實(shí)際治療情況相符。Todd等[25]通過分析160例患者所接受的167種可評(píng)估治療方案，發(fā)現(xiàn)靜脈注射兩性霉素B臨床上最常用且效果最好，治療成功率為77%；章強(qiáng)強(qiáng)等[26]報(bào)道的1例小型無綠藻所致腦膜炎病例中，使用兩性霉素B治療也獲得了良好療效。兩性霉素B或其脂質(zhì)體成為現(xiàn)今國(guó)外一線治療無綠藻病方案之一。其次，體外藥敏實(shí)驗(yàn)顯示兩性霉素B和四環(huán)素對(duì)抑制無綠藻屬有協(xié)同作用[27]，臨床上兩藥聯(lián)合治療取得成功[28]。

無綠藻對(duì)不同唑類藥物敏感性不同，不同種無綠藻對(duì)同一唑類藥物敏感性也有差別。在近10年的49例藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道，對(duì)伊曲康唑敏感的有17例，其中中型無綠藻2例[29-30]，小型無綠藻15例；對(duì)酮康唑敏感的2例，均為小型無綠藻。Linare[15]測(cè)定了104株無綠藻，顯示其對(duì)伏立康唑均敏感，MIC≤0.5 μg/mL。中型無綠藻和小型無綠藻對(duì)咪康唑敏感，其他型無綠藻則未發(fā)現(xiàn)對(duì)咪康唑的敏感性。無綠藻對(duì)唑類藥物以及多烯類藥物的敏感性可能是因?yàn)槠浼?xì)胞膜中性脂質(zhì)部分存在麥角固醇[31]，特別是小型無綠藻，麥角固醇的含量達(dá)到4%。此外，無綠藻對(duì)咪唑類的藥物敏感型呈現(xiàn)出顯著差別，細(xì)胞膜中游離脂肪酸含量的不同可能是其根本原因[2]。

抗細(xì)菌藥物中，無綠藻對(duì)氨基糖苷類抗生素 (阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、奈替米星、鏈霉素、妥布霉素)較敏感[32]。近年來國(guó)外研究者所做的藥敏實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)慶大霉素、卡那霉素對(duì)無綠藻的有效性[32-36]，其中慶大霉素的MIC在0.3～0.9 μg/mL之間。最近Morandi[32]報(bào)道奈替米星顯示出對(duì)無綠藻良好的抑制性，實(shí)驗(yàn)中奈替米星對(duì)無綠藻的MIC50為12 μg/mL，MIC90為24 μg/mL,且對(duì)于不同種無綠藻的MIC均相同。乳酸鏈球菌肽是由乳酸乳球菌產(chǎn)生的一種具有廣譜抗菌作用的細(xì)菌素。Morandi等[32]通過體外藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大部分中型無綠藻菌對(duì)不同濃度的乳酸鏈球菌肽敏感。

雖然各種體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異，但綜合所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，無綠藻屬對(duì)于5-氟胞嘧啶、灰黃霉素、磺胺類藥物、β-內(nèi)酰胺類抗生素、萬古霉素、紅霉素、氯霉素等是耐藥的。

5 常用鑒定方法

無綠藻的分型鑒定主要通過直接鏡檢、真菌培養(yǎng)以及組織病理學(xué)，近年來隨著分子生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，分子生物學(xué)鑒定成為無綠藻分型鑒定的重要手段，下面分別敘述。

5.1 直接鏡檢

10%氫氧化鉀溶液制片直接鏡檢，可見大量圓形、卵圓形或橢圓形孢子，大小不一，菌體透明，壁厚、無菌絲、芽孢及芽生現(xiàn)象，內(nèi)含特征性內(nèi)孢子。吳紹熙等[37]報(bào)道的由中型無綠藻引起的皮膚無綠藻病，皮損直接KOH涂片可見成團(tuán)的圓形或卵圓形單壁發(fā)亮不出芽孢子，直徑1.3～11 μm，有時(shí)可見多個(gè)直徑為4～5 μm的內(nèi)孢子。在組織病理學(xué)顯示皮下結(jié)節(jié)內(nèi)有大量圓形或橢圓形孢子，壁厚，內(nèi)有1～8個(gè)分隔。真菌直接鏡檢不能區(qū)分具體種。

5.2 真菌培養(yǎng)

常規(guī)培養(yǎng)條件下，肉眼觀察菌落形態(tài)呈潮濕、灰白色乳酪樣。中型無綠藻菌落表面平坦，中央紐扣狀，邊緣皺褶；小型無綠藻最適生長(zhǎng)溫度為30℃，菌落呈半球形，邊緣光滑，細(xì)胞形態(tài)和中型無綠藻相似但是更?。淮笮蜔o綠藻因?yàn)楫a(chǎn)生莢膜，菌落呈黏液樣，表面平坦，邊緣光滑，和小型無綠藻及中型無綠藻不同，大型無綠藻在37℃不能較好生長(zhǎng)只能在30℃生長(zhǎng)[2]；P.blaschkeae菌落表面平坦，中央紐扣狀，邊緣皺褶。此外，在章強(qiáng)強(qiáng)等[26]報(bào)道的1例小型無綠藻引起的腦部感染病例中，小型無綠藻在念珠菌顯色平皿 (CHROMagarCandida)上形成粉紅色菌落。

5.3 組織病理學(xué)

組織病理學(xué)檢查常顯示不同的形態(tài)，可表現(xiàn)為嚴(yán)重的肉芽腫樣壞死或無任何炎癥改變。大部分為炎性肉芽腫伴壞死；各種炎性細(xì)胞、組織細(xì)胞混合浸潤(rùn)；角化過度及假上皮瘤樣增生；局灶性角化不全；淋巴樣組織增生；可在表皮或真皮乳頭層中部及其他感染組織中發(fā)現(xiàn)孢子囊。在系統(tǒng)性無綠藻病中還可出現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞增多癥及膽囊、十二指腸和肝門等感染部位的纖維性變[2]。PAS染色可清晰分辨病原菌的形態(tài)與結(jié)構(gòu)，也可采用Gridley真菌染色法 (Gridley fungus stain)或Grocott-Gomori六胺銀改良法。無綠藻組織病理學(xué)特征為孢子囊形態(tài):圓形、卵圓形、橢圓形，內(nèi)含數(shù)個(gè)厚壁內(nèi)孢子，不出芽。HE染色不明顯，PAS染色明顯可見。小型無綠藻感染組織病理可見到桑葚樣、草莓樣孢子囊，當(dāng)孢子囊內(nèi)有許多分隔的母細(xì)胞 (內(nèi)孢子)就構(gòu)成車輪狀排列，而中型無綠藻無上述特點(diǎn)。除了常規(guī)染色，Pal等[38]通過對(duì)分離出的致病無綠藻屬應(yīng)用Narayan染色，成功顯示出其組織形態(tài)進(jìn)而鑒定。

5.4 生化特性

Arnold等[39]利用蔗糖、海藻糖、乳糖、肌糖、正丙醇、木糖等作為碳源進(jìn)行碳源同化實(shí)驗(yàn)對(duì)無綠藻屬進(jìn)行鑒定。這種生長(zhǎng)譜法結(jié)果可靠但花費(fèi)時(shí)間，一般需要2周才能明確鑒別。對(duì)海藻糖的利用可以作為鑒別中型無綠藻及小型無綠藻的主要手段：小型無綠藻可利用海藻糖但不能利用正丙醇，而中型無綠藻相反。偶爾碳源來源、純度及培養(yǎng)基的成分可能會(huì)給鑒定結(jié)果帶來偏差。利用藥敏特性也能幫助進(jìn)行無綠藻鑒定：中型無綠藻對(duì)克霉唑 (50 μg)耐藥，而小型無綠藻對(duì)克霉唑 (50 μg)敏感[40]；對(duì)新霉素的不同敏感性可以將大型無綠藻與中型無綠藻、小型無綠藻鑒別[41]。API 20C AUX、API 50、Vitek-2酵母鑒定系統(tǒng)及Rapid ID Yeast Plus test等商業(yè)化酵母鑒定試劑板可幫助鑒定菌種，但近來有實(shí)驗(yàn)利用經(jīng)典的酵母鑒定試劑板API 20C AUX鑒定的結(jié)果與分子生物學(xué)測(cè)序結(jié)果不符，分析認(rèn)為API 20CAUX可能是早年建立的數(shù)據(jù)庫，覆蓋的菌種庫相對(duì)有限，特別是隨著新的菌種及其變種或亞型不斷增多，商業(yè)化酵母鑒定試劑板有一定局限性。另外利用熒光抗體技術(shù)可以檢驗(yàn)無綠藻屬的感染,但不能確定種。

5.5 分子生物學(xué)

近年來發(fā)展的分子生物學(xué)的鑒定方法可將菌株鑒定至亞種或變種[42]，且與傳統(tǒng)真菌學(xué)檢查方法相比，具有耗時(shí)短、客觀、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

基因序列同源性分析法 目前真菌DNA序列分析的研究幾乎都集中在核糖體DNA (rDNA)上，核糖體大亞基 (LSU)D1D2區(qū)、小亞基 (SSU)D12D2區(qū)以及核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列ITS區(qū)在真菌核酸序列分析中，常用于真菌種水平的鑒定。其中LSU、ITS序列大小適中,因此在分類及鑒定中更為常用。2013年Hirose等[43]首次成功對(duì)小型無綠藻的ITS序列完整擴(kuò)增，并發(fā)現(xiàn)ITS片段在不同菌種間差別較大，大小順序是小型無綠藻>P.blaschkeae>中型無綠藻>P.cutis。朱利平、章強(qiáng)強(qiáng)等[44]通過D1/D2序列對(duì)兩株無綠藻鑒定至種的水平，然而無法通過ITS序列進(jìn)行鑒定，這可能是由其低覆蓋率和或低相似度造成。2014年Marques等[12]優(yōu)化PCR條件，通過向PCR反應(yīng)中添加5%DMSO，實(shí)現(xiàn)了完整ITS區(qū)域的穩(wěn)定擴(kuò)增，對(duì)14株P(guān).blaschkeae和18株中型無綠藻2型成功鑒定，并發(fā)現(xiàn)中型無綠藻2型的ITS序列長(zhǎng)度雖然相較P.blaschkeae更短，但是種內(nèi)多樣性更加顯著。

基于PCR的分子技術(shù) ①PCR-SSCP:聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (PCR-SSCP)是基于PCR 的單鏈構(gòu)象多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)?；具^程是:PCR擴(kuò)增靶DNA；將特異的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性，而后快速?gòu)?fù)性，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子；將適量的單鏈DNA進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結(jié)果。2012年Cremonesi等[45]利用此技術(shù)對(duì)50個(gè)臨床分離株成功進(jìn)行鑒定，對(duì)18S rDNA基因的兩個(gè)區(qū)域PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同種菌株遷移速率存在差別，由快到慢分別是中型無綠藻基因型2>中型無綠藻基因型1>P.ulmea>P.blaschkeae>大型無綠藻。雖然PCR-SSCP技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)單、高度重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)，并可以鑒定出傳統(tǒng)PCR方法無法鑒定的P.ulmea和大型無綠藻，但此技術(shù)對(duì)于無綠藻的鑒定也有一定局限性，例如反應(yīng)對(duì)溫度和pH較敏感及DNA片段長(zhǎng)度的限制。②PCR-RFLP:PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (Restriction FragmentLength Polymorphism，RFLP) 技術(shù)的原理是PCR擴(kuò)增目的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物再用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點(diǎn)分布不同，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA片段條帶。這種方法對(duì)DNA 的量和純度沒有很高的要求，可簡(jiǎn)化圖譜的帶型，易于分析[46]。2008年，Aouay等[47]利用此技術(shù)對(duì)分離自患有乳腺炎奶牛的30株中型無綠藻菌進(jìn)行基因分型，結(jié)果有27株為中型無綠藻基因型2，3株為中型無綠藻基因型3 (即P.blaschkeae)，結(jié)果與基因型特異性PCR鑒定結(jié)果一致。2010 年Tomasz Jagielski等[48]利用同樣技術(shù)成功對(duì)分離自患有乳腺炎奶牛的44個(gè)無綠藻菌株進(jìn)行分型。③兩步法熒光定量PCR技術(shù)/DNA分辨率溶解曲線分析 (two step Real Time PCR reaction followed by DNA Resolution Melting Analysis):Two-stepqPCR/RMA是一種快速、高通量的鑒定方法，相比于傳統(tǒng)的分子學(xué)鑒定更加準(zhǔn)確、穩(wěn)健、性價(jià)比高。2010年Ricchi等[49]運(yùn)用此種方法成功鑒定了中型無綠藻基因型1、中型無綠藻基因型2和P.blaschkeae。然而由于全世界范圍內(nèi)缺乏大型無綠藻、小型無綠藻及P.ulmea的保存培養(yǎng)株，第二步qPCR能否用于更多無綠藻種的鑒定有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。④RAPD-PCR:隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)技術(shù)也是快速、經(jīng)濟(jì)、具有高分辨能力進(jìn)行無綠藻鑒定的手段之一。近期，Morandi等[32]運(yùn)用RAPD技術(shù)成功將意大利、巴西兩地分離出的49株無綠藻進(jìn)行種的分型。實(shí)驗(yàn)中，RAPD-PCR的重現(xiàn)性高于90%，使用的10個(gè)引物中，M13、OPA-4和OPA-18表現(xiàn)出清晰、可重復(fù)的擴(kuò)增能力較適合用于鑒定，這3個(gè)單引物的Simpson指數(shù)分別為0.94、0.92和0.85，三種引物聯(lián)合使用的Simpson指數(shù)為0.98。對(duì)于原核生物和真核生物，RAPD-PCR是十分實(shí)用的鑒定途徑[50]，和其他分子技術(shù)的聯(lián)合使用對(duì)于鑒定發(fā)現(xiàn)無綠藻新的基因型提供可能。⑤ISSR-PCR:ISSR (inter-simple sequence repeat)是一種基于微衛(wèi)星序列發(fā)展起來的新的標(biāo)記技術(shù)，簡(jiǎn)便、穩(wěn)定，可以鑒定基因水平上更微小的差異。Morandi等[32]在RAPD-PCR基礎(chǔ)上，結(jié)合ISSR技術(shù)得到了42株中型無綠藻2型間的相似系數(shù)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)同種間的分子水平差異。

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDI-TOF)是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，其無論是在理論上還是在設(shè)計(jì)上都十分簡(jiǎn)單高效，很適合對(duì)蛋白質(zhì)、多肽、核酸和多糖等生物大分子研究。1996年Holland等[51]首次報(bào)道運(yùn)用MALDI-TOF技術(shù)對(duì)微生物進(jìn)行鑒定。2012 年J.Murugaiyan等[52]應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)對(duì)290株臨床無綠藻菌株成功進(jìn)行鑒定，并發(fā)現(xiàn)中型無綠藻和P.blaschkeae在3-20kDa范圍內(nèi)顯示出特征性質(zhì)譜出現(xiàn)高峰。J.Murugaiyan等在傳統(tǒng)步驟上還使用了超聲處理以提高質(zhì)譜質(zhì)量，同時(shí)建立主要光譜庫 (main spectra library，MSP)將這種光譜圖的可重復(fù)性進(jìn)一步加強(qiáng)。

6 小 結(jié)

我國(guó)人口基數(shù)大、環(huán)境復(fù)雜，無綠藻病的實(shí)際發(fā)病率可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過目前的文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)，一方面是無綠藻病臨床癥狀缺乏特異性，另一方面對(duì)此菌的鑒定特征缺乏足夠認(rèn)識(shí)，導(dǎo)致目前無綠藻病的診斷率遠(yuǎn)低于實(shí)際感染率。隨著科技發(fā)展，技術(shù)提升，深入了解無綠藻的微生物學(xué)特性，全方位探索無綠藻的鑒定方法對(duì)于了解我國(guó)無綠藻得分布與感染在流行病學(xué)具有重要意義，也能提升我國(guó)在罕見真菌病中的診斷水平與國(guó)際地位。

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