李蘊(yùn)玉,張召興,李佩國(guó),張香齋,賈青輝,閆艷娟,常超越

(河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 秦皇島 066604)

目前,由于抗球蟲藥物殘留和耐藥蟲株等問(wèn)題的出現(xiàn),使得新型疫苗的研發(fā)成為預(yù)防雞球蟲病的主要發(fā)展方向。EtMIC-2是球蟲微線上的一類酸性蛋白質(zhì),在阻斷子孢子侵入宿主細(xì)胞時(shí)起重要作用[1]。已有研究表明,EtMIC-2基因的表達(dá)產(chǎn)物能誘導(dǎo)雞體對(duì)E.tenella產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)作用[2],并對(duì)堆型艾美耳球蟲的感染也有交叉保護(hù)作用[3],因而EtMIC-2基因是一個(gè)良好的疫苗候選基因。

細(xì)胞因子作為疫苗高效免疫增強(qiáng)劑的研究已成為免疫佐劑研究的一個(gè)新方向。Min等[4]發(fā)現(xiàn),IL-2等細(xì)胞因子聯(lián)合運(yùn)用可明顯增強(qiáng)堆型艾美耳球蟲pcDNA3-1E的免疫效果,降低球蟲的復(fù)制,提高肉雞增重。侯洪烈等[5]構(gòu)建的基因重組卡介苗pMV261-ADF-IL-2和pMV361-ADF-IL-2對(duì)E.tenella卵囊的攻擊具有一定的保護(hù)作用,其ACI分別為176.08和172.89。但雞IL-2對(duì)球蟲EtMIC-2質(zhì)粒的免疫增效作用尚未見報(bào)道。為此,本研究將構(gòu)建的pcDNA3.0-IL-2、pcDNA3.0-EtMIC-2 和 pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2質(zhì)粒分別免疫雛雞,研究其對(duì)E.tenella卵囊攻毒后的免疫保護(hù)效果,為新型球蟲疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 球蟲卵囊、質(zhì)粒E.tenella河北株孢子化卵囊、pcDNA3.0-IL-2、pcDNA3.0-EtMIC-2 和pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2質(zhì)粒均由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;雞球蟲四價(jià)活疫苗,購(gòu)自佛山市正典生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡海藍(lán)褐雛雞,飼喂無(wú)抗球蟲藥的全價(jià)飼料。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與指標(biāo)測(cè)定 將240只試驗(yàn)用雞于14日齡早晨逐只空腹稱重,根據(jù)體重離散度隨機(jī)分成8組,每組30只,第1、2組分別為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照,在14、21日齡時(shí),第3組每只肌肉注射pcDNA3.0-IL-2 100 μg,第 4 組每只肌肉注射 pcDNA3.0-EtMIC-2 100 μg,第 5、6、7 組每只分別肌肉注射 50 μg、100 μg、150 μg 重組 pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2質(zhì)粒,第8組在21日齡滴口免疫雞球蟲病四價(jià)活疫苗,陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組用PBS代替。飼養(yǎng)至28日齡時(shí),除第2組(陰性對(duì)照組)外,每只雞經(jīng)口灌服4×104個(gè)E.tenella卵囊,試驗(yàn)期間觀察記錄各組雞的精神、食欲及排泄物狀況,對(duì)死亡雞剖檢并記錄死亡原因,試驗(yàn)至35日齡結(jié)束。按照美國(guó)默克(Merck)公司的計(jì)算公式計(jì)算ACI,ACI=(存活率+相對(duì)增重率)-(病變值+卵囊值)[6]。ACI≤120為無(wú)效,ACI=120～160為中等有效,ACI=160～180為良好,ACI>180為優(yōu)秀。

1.3.1 相對(duì)增重率 相對(duì)增重率(%)=(陽(yáng)性對(duì)照組以及各免疫組雞平均增重/陰性對(duì)照組雞平均增重)×100%。

1.3.2 存活率 存活率(%)=(組內(nèi)雞存活數(shù)/組內(nèi)雞總數(shù))×100%。

1.3.3 病變值 于感染球蟲后第7天(即35日齡),隨機(jī)取5只雞剖殺,按Johnson等[7]的方法做雞的盲腸病變記分,兩側(cè)盲腸病變不一致時(shí)以嚴(yán)重一側(cè)為準(zhǔn)。病變值=每組平均病變記分×10。

1.3.4 卵囊值 于感染球蟲后第7天收集各組雞的糞便,碾碎并攪勻,然后稱取2 g,加入60 mL飽和鹽水,經(jīng)充分?jǐn)噭蚝?用McMaster′s法計(jì)數(shù),計(jì)算克糞便卵囊數(shù)(OPG值)。卵囊比數(shù)=(陰性對(duì)照組或試驗(yàn)組卵囊數(shù)/陽(yáng)性對(duì)照數(shù)卵囊數(shù))×100%,卵囊值與卵囊比數(shù)關(guān)系如下:卵囊比數(shù)分別為1%以下,1%～25%,26%～50%,51%～75%和76%～100%時(shí),卵囊值分別為0,5,10,20和40。

2 結(jié)果與分析

由表1可知,試驗(yàn)期間,陰性對(duì)照組雞的精神、食欲、糞便均無(wú)明顯異常,也未出現(xiàn)死亡。而陽(yáng)性對(duì)照組和免疫各組在攻蟲后第4天出現(xiàn)不同程度的稀便、血便和死亡,其中6、7、8組存活率和相對(duì)增重率最高,存活率均達(dá)95%,相對(duì)增重率分別為81.3%、81.7%和 82.9%,陽(yáng)性對(duì)照組最低,存活率和相對(duì)增重率分別為70%和71.8%,其余各免疫組的存活率和相對(duì)增重率介于兩者之間。各免疫組的病變值均低于陽(yáng)性對(duì)照組,其中7、8組的病變值最低,均為6.7。各攻蟲組在攻蟲后均有不同數(shù)量的卵囊排出,其中以陽(yáng)性對(duì)照組和3組排出量最多,卵囊值均為40,而6、7、8組的卵囊值最低,均為5,其他免疫組的卵囊值介于二者之間。若以ACI綜合評(píng)價(jià)其抗球蟲效果,陽(yáng)性對(duì)照組ACI僅為71.8,提示本次感染的E.tenella卵囊的毒力較強(qiáng)。3～8組的 ACI較陽(yáng)性對(duì)照組分別提高了 18.25%、82.14%、97.63%、127.02%、129.81%和 131.48%,說(shuō)明各重組質(zhì)粒對(duì)E.tenella卵囊的感染均具有一定的保護(hù)作用,且免疫 pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2對(duì)E.tenella卵囊感染的免疫保護(hù)效果優(yōu)于單獨(dú)免疫 pcDNA3.0-IL-2和 pcDNA3.0-Et-MIC-2組,并隨免疫劑量的增加,其ACI呈上升趨勢(shì),其中6、7組的ACI均達(dá)到160以上,呈現(xiàn)抗球蟲效果良好水平,并與球蟲活疫苗組的ACI相當(dāng)。

3 討論

目前,在雞球蟲疫苗研制方面,如何增強(qiáng)基因工程疫苗的免疫效果成為研究的一個(gè)熱點(diǎn),選用適當(dāng)?shù)淖魟┤缂?xì)胞因子來(lái)提高雞球蟲基因工程疫苗的免疫效果是目前常采取的策略之一。據(jù)報(bào)道,雞IL-2作為新型免疫增強(qiáng)劑可顯著增強(qiáng)雞傳染性囊病[8]、雞新城疫[9]、禽流感[10-12]等疫苗的免疫效力,提高抗體整齊度和延長(zhǎng)抗體持續(xù)時(shí)間。目前,發(fā)現(xiàn)雞IL-2在抗球蟲方面也起一定作用。謝昆等[13]研究表明,重組IL-2蛋白能有效減輕攻蟲后盲腸病理變化、降低卵囊排出量、增加相對(duì)增重。Min等[4]發(fā)現(xiàn),IL-2等細(xì)胞因子聯(lián)合運(yùn)用可明顯增強(qiáng)堆型艾美耳球蟲pcDNA3-1E免疫的效果,降低球蟲的復(fù)制,提高肉雞的增重。侯洪烈等[5]報(bào)道,pMV261-ADF-IL-2和pMV361-ADF-IL-2重組卡介苗對(duì)E.tenella卵囊的攻擊具有一定的保護(hù)作用,其ACI分別為176.08和172.89。 本試驗(yàn)結(jié)果表明,將構(gòu)建的pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2重組質(zhì)粒分別以 50、100、150 μg/只的劑量免疫雛雞,其ACI分別比陽(yáng)性對(duì)照組提高了 97.63%、127.02%、129.81%,與免疫 pcDNA3.0-IL-2 和 pcDNA3.0-EtMIC-2組比較,其 ACI分別提高了 67.14%、91.99%、94.35%和 14.81%、31.88%、33.50%。 由此說(shuō)明,免疫pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2重組質(zhì)粒對(duì)E.tenella感染的免疫保護(hù)效果優(yōu)于單獨(dú)免疫pcDNA3.0-IL-2 和 pcDNA3.0-EtMIC-2 組,并隨免疫劑量的增加,其ACI呈上升趨勢(shì),其中當(dāng)免疫劑量為100、150 μg/只時(shí),抗E.tenella攻擊的保護(hù)率均高達(dá)95%,并能抑制卵囊的繁殖,減輕對(duì)腸道的損傷,提高雞的增重,從而使ACI均高于160,達(dá)到抗球蟲良好的水平,與球蟲疫苗組相當(dāng),這表明雞IL-2能明顯增強(qiáng)EtMIC-2質(zhì)粒的免疫效果,提高其免疫保護(hù)作用。

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