張文通 魏 鳳李 峰王金良 苗立中沈志強,

（1山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；2山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

隨著規(guī)模化養(yǎng)殖加速發(fā)展，豬病變得極為復雜，僅靠傳統(tǒng)診斷效果并不理想。目前從事豬病實驗室檢測服務的單位主要有農(nóng)業(yè)高校或科研院所、飼料廠或獸藥廠、規(guī)模養(yǎng)豬場及剛剛興起的“第三方”專業(yè)檢測機構等[1-4]。這些服務機構在檢測豬病病原時使用最多的方法是PCR方法。PCR方法因其特異、敏感、快速等優(yōu)點，獲得檢測人員的高度認可。但在應用PCR方法過程中，如果操作不規(guī)范，就會出現(xiàn)“假陽性”或“假陰性”等錯誤結果，從而誤導豬場防疫工作[5-8]。本文對應用PCR方法檢測豬病臨床病料的一些注意事項進行了概述，以期為檢測人員規(guī)范操作提供參考。

1 PCR方法介紹

聚合酶鏈式反應，PCR（Polymerase Chain Reaction），是一種體外DNA擴增技術，由高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸等反應組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增，從而在短時間內(nèi)獲得所需的大量特定基因片段。目前常用的豬病病原PCR檢測方法包括普通RCR或RT-PCR、多重PCR或RT-PCR、套式PCR或RT-PCR及實時熒光定量PCR等。

2 PCR方法在臨床應用中的注意事項

2.1 對方法要求

使用PCR方法檢測某種豬病，需要依據(jù)相應的檢測標準。檢測標準有的是檢測人員或單位自建的，有的是來自參考文獻，比如文章、論文、專利或標準等。推薦應用國家或行業(yè)認可的標準檢測方法。比如檢測偽狂犬病毒的PCR方法國家標準為GB/T 18641-2002，豬圓環(huán)病毒的PCR方法國家標準為GB/T 21674-2008，鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒高致病性與經(jīng)典株復合RT-PCR方法國家標準為GB/T 27517-2011，豬鏈球菌2型PCR定型檢測技術國家標準為GB/T 19915.3-2005，等等。建議檢測人員按照國家或行業(yè)標準操作，檢測結果具有高度準確性或認可性。

2.2 對硬件設施要求

進行PCR試驗，需要分區(qū)操作，包括模板提取區(qū)、配液區(qū)、PCR擴增區(qū)和電泳區(qū)。要求人流及物流嚴格按照模板提取區(qū)—配液區(qū)—PCR擴增區(qū)—電泳區(qū)路線單向流動，嚴禁倒流。人流與物流通道分開，配液應在生物安全柜中進行，電泳區(qū)應有排風及污染物處理設施。這4個區(qū)域應配套專用的移液器、槍頭、工作服、手套及垃圾桶等耗材，嚴禁相互交叉使用。還需強調(diào)的是：如果做相關基因克隆、質(zhì)粒提取等工作，禁止在這4個區(qū)域操作。上述所有要求都是為了防止“氣溶膠污染”。為規(guī)范操作，檢測人員應做好儀器使用、試劑領取和使用記錄。為避免頻繁反復凍融PCR試劑，如反轉錄酶、rTaq酶、引物等，可將其分裝成小份使用。對于PCR所用的槍頭，要高壓處理，如果槍頭用于提取和反轉錄RNA、還需用DEPC水處理。有條件的實驗室可做好儀器定期校準驗證工作。

2.3 對樣本要求

對樣本總的要求是新鮮、典型、適量及標識清楚等。送檢人員需要根據(jù)流行病學調(diào)查、臨床問診及剖檢結果，對病死豬或病豬病因作出一些推斷；根據(jù)推斷病原，無菌采集典型病變組織，裝入自封袋并標識清楚，放入裝有冰袋的泡沫箱以最快速度運送至送檢單位。

對于豬瘟，主要采集扁桃體、淋巴結、全血、脾、腎；對于豬繁殖與呼吸綜合征，主要采集血液、肺、脾、扁桃體、淋巴結；對于豬流行性乙型腦炎，主要采集患病仔豬或死胎兒的腦組織、腦積液和血液；對于豬細小病毒病，主要采集死胎或腎、淋巴結、性腺；對于豬偽狂犬病，主要采集淋巴結、肺、扁桃體、腦；對于豬圓環(huán)病毒2型，主要采集肺、胰臟、腎、淋巴結；對于豬口蹄疫，主要采集水泡皮、水泡液、心臟；對于豬傳染性胃腸炎，主要采集腸、腸內(nèi)容物；對于豬流行性腹瀉，主要采集糞便、腸內(nèi)容物；對于豬輪狀病毒病，主要采集糞便、腸內(nèi)容物；對于豬巴氏桿菌?。ㄘi肺疫），主要采集肺（帶氣管）、淋巴結；對于豬大腸桿菌病，主要采集小腸及內(nèi)容物、肺臟、心臟；對于豬鏈球菌病，主要采集肝、脾、淋巴結、肺、血液；對于副豬嗜血桿菌感染，主要采集肺、腦、關節(jié)液、淋巴結；對于豬傳染性胸膜肺炎，主要采集肺、肝臟、全血、胸水；等等。

2.4 對操作要求

從事PCR檢測的操作人員一定要有質(zhì)量意識。每次PCR檢測除了樣本外，一定要設置陰陽性對照；嚴格、詳細做好實驗記錄；注意在每個操作區(qū)更換工作服、鞋、口罩、手套等；在核酸提取和配液過程中，每添加1種試劑，更換槍頭；每天做完試驗，及時清場，進行消毒；注意個人防護，禁止在試驗區(qū)域飲食，禁止不穿工作服進入試驗區(qū)域，試驗過程中或結束后要用肥皂洗手等。

2.5 PCR檢測結果對后續(xù)分析要求

大多PCR檢測結果僅告訴送檢人員有無某個病原，并不能區(qū)分是野毒還是疫苗毒、強毒還是弱毒，不能區(qū)分病原的基因型。這就需要進一步對送檢陽性病料中病原基因組擴增并測序，分析該病原是野毒還是疫苗毒、強毒還是弱毒以及基因型信息，從而推測病原來源以及與疫苗毒株的同源性等，更加精準指導生產(chǎn)。

3 小結

PCR檢測在豬病診斷領域已得到廣泛應用。但在實踐中往往會出現(xiàn)同一份病料送到不同檢測單位的檢測結果并不一致的現(xiàn)象。提示檢測單位的PCR操作水平高低不一，究其原因可能是有些檢測單位沒有獲得國家認可的資質(zhì)，沒有嚴格的質(zhì)量管理體系。目前國家正在開展中國合格評定國家認可委員會（CNAS）認證和中國計量認證（CMA）工作，建議養(yǎng)豬場在送檢病料時，選擇有資質(zhì)的機構進行檢測。