趙勁風，史夏青，王成志，楊滿意，劉玲，廖明媚

（中南大學湘雅醫(yī)院 衛(wèi)生部納米生物技術(shù)重點實驗室，湖南 長沙 410008）

肺癌是世界最常見的癌癥之一，因其確診較晚，導致預(yù)后不良，發(fā)病率和病死率持續(xù)上升，已是我國癌癥病死率的第1位[1]。吸煙會大幅增加吸煙者患肺癌的風險，且導致約90%的肺癌患者死亡[2]。香煙煙霧是包含超過4 000多種化學物質(zhì)的復(fù)雜混合物，大部分是有害物質(zhì)或致癌物，包括尼古丁、芳香烴、醛及氰化物等[3]。尼古丁是香煙煙霧中以酸鹽形式存在的主要化學成分，在肺部吸收，被認為是吸煙成癮的主要因素[4-5]。

近年來的文獻報道[6-7]，肺癌治療的效果可被尼古丁所影響，其作用機制為尼古丁通過調(diào)控細胞內(nèi)各種不同信號通路來促進肺癌細胞增殖、侵襲和血管生成，并抑制肺癌細胞的凋亡。例如：尼古丁可以從肺癌細胞的乙酰膽堿受體上取代乙酰膽堿，導致Ca2+內(nèi)流，并激活PI3K，AKT，MAPK，PKC等蛋白激酶，促進增殖，使癌細胞凋亡減少[8]。本文主要闡述尼古丁影響B(tài)細胞淋巴瘤/白血病2（B cell lymphoma/leukelia-2,Bcl-2）家族蛋白的表達進而促進肺癌的發(fā)展并降低化療藥物的敏感性。

1 尼古丁的化學性質(zhì)及作用

尼古丁是煙草的主要成分，它含有1個吡啶基和1個吡咯環(huán)，2個結(jié)構(gòu)上都帶有1個叔胺，可以在煙堿乙酰膽堿受體（nAChRs）的多個位置選擇性結(jié)合。人體大腦、肺、神經(jīng)肌肉接頭、腎上腺髓質(zhì)和神經(jīng)節(jié)等都有nAChRs[9]。當尼古丁經(jīng)吸煙吸入時，通過肺部擴散進入循環(huán)，最終進入大腦刺激多巴胺釋放，使吸煙者感覺十分愉悅，所以尼古丁是吸煙成癮的主要原因[4]。

在煙草加工和吸煙時尼古丁可以通過亞硝化作用轉(zhuǎn)化為4-甲基亞硝胺-1（3-吡啶基）-1-丁酮、4-甲基亞硝胺-1（3-吡啶基）-1-丁醇（NNK）和N-亞硝基去甲基尼古?。∟NN），入機體后迅速的被吸收并分布到整個機體[10]。尼古丁及其衍生物（NNK，NNN）可誘導各種癌細胞（包括肺、胰腺、膀胱、頭、頸和神經(jīng)膠質(zhì)）的存活、增殖、遷移及侵襲等[11]。尼古丁通過激活癌細胞上的nAChRs，進而激活或直接增強下游抗凋亡信號通路級聯(lián)反應(yīng)，促進腫瘤生存，抑制癌細胞凋亡[12]。

2 肺癌耐藥性的產(chǎn)生及機制

化療成為治療中晚期肺癌的重要手段[13]，可以提高肺癌患者的生存率，減輕癥狀，提高生活質(zhì)量。但是在化療過程中，肺癌細胞對化療藥物容易產(chǎn)生耐受性，導致化療失敗，這加劇了肺癌患者的不良預(yù)后從而導致高病死率[14]。近年來研究表明[14-16]，肺癌耐藥的產(chǎn)生與腫瘤細胞DNA修復(fù)、細胞信號傳導中相關(guān)因子（PKC、PI3-K/AKT、NF-κB等）及凋亡相關(guān)基因（P53、Survivin、Bcl-2基因家族等）的表達異常存在密切聯(lián)系。

3 尼古丁增強肺癌耐藥性與Bcl-2家族蛋白的關(guān)系

3.1 Bcl-2家族與細胞凋亡

Bcl-2這一基因家族主要與細胞凋亡有關(guān)，可以調(diào)控線粒體膜通透性，釋放凋亡因子細胞色素C和激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)等，是細胞凋亡過程中重要的調(diào)控因子[17]。Bcl-2蛋白家族可以分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，促凋亡蛋白由BH123和BH3-only 2個亞族組成，BH123亞族主要包含Bak和Bax，而BH3-only亞族包括Bid、Bim、Bad、Bik、Puma和Noxa；抗凋亡蛋白由Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bcl-w、Bcl-b和A1等組成[18]。細胞沒有凋亡刺激時，抗凋亡蛋白在線粒體外膜上結(jié)合BH123蛋白和Bak、Bax，從而抑制其活化，所有抗凋亡蛋白都可以隔離Bax，而只有Mcl-1和Bcl-xl可以結(jié)合Bak。細胞在接受凋亡刺激之后，BH3-only蛋白部分與抗凋亡蛋白結(jié)合，使抗凋亡蛋白不能再與BH123蛋白相互作用，或直接與BH123蛋白結(jié)合以激活它們?；罨腂ax和Bak同二聚化，誘導細胞色素C和其他膜間蛋白釋放到細胞質(zhì)中，使半胱天冬酶激活，然后是DNA片段化，最終導致細胞死亡[6，17，19]。因此，Bcl-2家族蛋白的表達及其之間的相互作用可以影響細胞凋亡。

3.2 BH123亞族與尼古丁增強肺癌耐藥性的關(guān)系

3.2.1 BH123亞族的結(jié)構(gòu)與功能 Bax和Bak是Bcl-2基因家族中具有BH1-3同源結(jié)構(gòu)區(qū)域，對細胞凋亡起促進作用的BH123亞族成員，是細胞內(nèi)源性凋亡途徑（包括DNA損傷）必不可少的凋亡誘導因子[20]。在正常生理狀態(tài)下，Bax主要以單體形式位于細胞質(zhì)中或吸附在線粒體外膜上，可形成Bax/Bcl-xl、Bax/Bcl-2異二聚體；Bak不同于Bax，大多數(shù)Bak以Bak/Mcl-1、Bak/Bcl-xl異二聚體的形式吸附在線粒體外膜上。細胞凋亡發(fā)生時，Bax和Bak均吸附到線粒體膜上，形成寡聚體，促進凋亡[21]。

3.2.2 BH123亞族與尼古丁誘導肺癌細胞的生存與耐藥的研究 大多數(shù)肺癌細胞系都可檢測出高水平的內(nèi)源性Bax和Bak，且在肺癌細胞死亡時表達很高。其中，Bax已被確定可以作為肺癌治療的預(yù)后指標，為肺癌治療提供了一個新靶點[22]。尼古丁誘導肺癌細胞的生存與耐藥主要與Bax有關(guān)，與Bak關(guān)系的相關(guān)研究甚少。在凋亡過程中，Bax的促凋亡活性可以通過調(diào)節(jié)磷酸化，翻譯后修飾水平來調(diào)控。Bax的磷酸化S184位點位于其疏水羧基末端，調(diào)控Bax在細胞內(nèi)的定位及其插入線粒體膜的能力[23]。尼古丁可以激活Bax的激酶AKT，AKT與Bax在細胞內(nèi)共同作用，并且使Bax磷酸化。Bax的磷酸化使其不能結(jié)合到線粒體膜上，從線粒體進入細胞質(zhì)，且Bax蛋白的半衰期減短。尼古丁還可以激活Bax的激酶PKC，PKC可直接在肺癌細胞中磷酸化Bax。因此，尼古丁誘導的肺癌細胞的生存與耐藥性是通過激活PI3K/AKT通路實現(xiàn)的，使Bax磷酸化失去促凋亡功能[23-24]。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了特異性靶向的Bax激動劑SMBA1-3，可以在Bax的S184位點處結(jié)合引起B(yǎng)ax構(gòu)象變化，促進Bax寡聚化，導致肺癌細胞凋亡[25]。對于Bax磷酸化，發(fā)現(xiàn)蛋白磷酸酶2（PP2A）可作為一種Bax調(diào)節(jié)性磷酸酶發(fā)揮作用，不僅使Bax去磷酸化，而且激活Bax促凋亡功能[26]。因此，SMBAs和PP2A可以作為一種潛在的靶向Bax的新型抗癌藥物，專門用于治療肺癌。

3.3 BH3-only亞族與尼古丁增強肺癌耐藥性的關(guān)系

3.3.1 BH3-only亞族的結(jié)構(gòu)與功能 BH3-only亞族蛋白只有1個保守的BH3結(jié)構(gòu)區(qū)域，包括Bid，Bim，Bad，Bik，Puma和Noxa等，通過線粒體凋亡途徑啟動細胞凋亡程序的，在凋亡的啟動及凋亡通路的溝通中發(fā)揮著極其重要的作用[27]。BH3-only蛋白主要通過結(jié)合抗凋亡蛋白并抑制其活性，使Bax和Bak釋放，引起線粒體外膜透化，激活半胱天冬酶的級聯(lián)反應(yīng)，引起細胞凋亡[28]。

3.3.2 BH3-only亞族與尼古丁誘導肺癌細胞的生存與耐藥的研究 BH3-only亞族蛋白成員Bad、Bim、Puma和Noxa在肺癌細胞中均可檢測到有表達。Bad在大多數(shù)肺癌細胞系中都有高表達，且與其生存和耐藥有很大關(guān)系。Bim的表達水平的降低或Bim缺失多態(tài)性的存在會降低肺癌治療效果，且影響術(shù)后患者的預(yù)后。而Puma和Noxa在肺癌細胞中的表達與其發(fā)病機制可能并沒有很重要的關(guān)系[29]。

尼古丁誘導肺癌細胞的生存與耐藥主要與Bad相關(guān)。Bad是BH3-only亞族中的一個重要蛋白，可以在S112，S136和S155 3個位點發(fā)生磷酸化，其促凋亡活性主要與磷酸化水平相關(guān)[30]。據(jù)報道，尼古丁可以激活肺癌細胞內(nèi)的MAPK ERK1/2，AKT和PKA等激酶，引起B(yǎng)ad先后在S112，S136和S155 3個位點磷酸化，磷酸化的Bad不再與Bcl-2或者Bcl-xl結(jié)合，從線粒體膜上轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)，并與細胞質(zhì)中的14-3-3蛋白相互作用，失去其促凋亡活性[31]。

近年來，也有文獻報道針對MAPK ERK1/2，AKT和PKA等激酶活化的抑制劑。PD98059和U0126是常見的MAPK ERK1/2激酶抑制劑[32]。AKT位于PI3K-AKT信號轉(zhuǎn)導通路的核心位置，在調(diào)控細胞凋亡、增殖和代謝等多種生理活動中發(fā)揮重要功能，已有十幾個AKT小分子抑制劑進入臨床開發(fā)階段，如：LY294002，哌立福新，MK2206，GSK2110183等[33-34]。H89是已經(jīng)證明可以在肺癌細胞中抑制PKA激酶活化。這些對于激活Bad磷酸化的蛋白激酶有顯著抑制效果的分子抑制劑，均可作為潛在的肺癌治療藥物[35]。

3.4 抗凋亡蛋白與尼古丁增強肺癌耐藥性的關(guān)系

3.4.1 抗凋亡蛋白的結(jié)構(gòu)與功能 抗凋亡蛋白Bcl-2基因家族中具有BH1-4同源結(jié)構(gòu)區(qū)域，由Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bcl-w、Bcl-b和A1等組成。抗凋亡蛋白可以直接與Bax或Bak結(jié)合使其失活，并且可以競爭性的與BH3-only蛋白結(jié)合抑制其發(fā)揮凋亡活性，從而減少細胞凋亡[36]。一些惡性腫瘤細胞通過提高Bcl-2家族的抗凋亡蛋白表達來逃避凋亡，進而過度增殖。因此，抗凋亡蛋白成為抗癌治療的可能靶點。

3.4.2 抗凋亡蛋白與尼古丁誘導肺癌細胞的生存與耐藥的研究 抗凋亡蛋白在肺癌細胞耐藥性產(chǎn)生過程中起到了重要的作用，抗凋亡蛋白通過抑制肺癌細胞的凋亡、延長細胞生存時間等機制，誘導肺癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。因此，抗凋亡蛋白在肺癌細胞中均過表達，其中Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1的表達最為顯著。目前關(guān)于尼古丁誘導肺癌細胞的生存與耐藥的研究大部分與Mcl-1和Bcl-2這2個蛋白相關(guān)[12]。

Mcl-1是Bcl-2家族成員中一種獨特的抗凋亡蛋白，具有較短的半衰期和短期抗凋亡功能。在凋亡過程中，Mcl-1通過抑制Bax、Bak、BH3-only蛋白起負調(diào)控內(nèi)源性凋亡的作用[37]。Mcl-1表達在多個水平上受到嚴格調(diào)控，包括轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后和轉(zhuǎn)錄翻譯后過程，在許多腫瘤中過表達，Mcl-1的高表達與腫瘤耐藥和復(fù)發(fā)密切相關(guān)[38]。Mcl-1在各種人類肺癌細胞中廣泛表達，與肺癌細胞的增殖與耐藥有重要關(guān)系。尼古丁上調(diào)Mcl-1在各種人類肺癌細胞中的表達水平，還通過上游β-腎上腺素受體激活ERK1/2通路，其誘導Mcl-1可以在PEST區(qū)域的T163位點磷酸化。在尼古丁誘導Mcl-1的T163位點處磷酸化顯著延長Mcl-1的半衰期，從1.5～2.2 h延長至5～6 h，導致肺癌細胞長期存活和對化療藥物的耐藥性[11，39]。因此，Mcl-1的抗細胞凋亡功能的破壞可以通過阻斷其T163位點磷酸化，代表治療煙草相關(guān)癌癥的新策略，尤其適用于肺癌和其他Mcl-1高表達的惡性腫瘤。

Bcl-2是肺癌細胞程序性死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，研究表明長期吸煙的肺癌患者的癌細胞中可以檢測到高表達的Bcl-2，因此Bcl-2與肺癌之間有密切的關(guān)系。尼古丁可以上調(diào)肺癌細胞的Bcl-2的表達，使肺癌細胞對凋亡刺激的敏感性降低，且對于化療藥物的耐藥性增加[22]；尼古丁對于Bcl-2的調(diào)節(jié)還表現(xiàn)在磷酸化水平，Bcl-2可以在T69，S70和S87多個位點發(fā)生磷酸化，S70位點是尼古丁誘導Bcl-2發(fā)生磷酸化的主要位點，且尼古丁通過激活PKCα和MAPK ERK1/2激酶激活Bcl-2在S70位點的磷酸化[17]；此外，尼古丁誘導Bcl-2磷酸化還可以增強Bcl2/Bax異源二聚化，阻斷Bax的促凋亡作用。在化療藥物治療肺癌的過程中，Bcl-2與Keap1結(jié)合，促進Bcl-2泛素化并且降解，尼古丁可以抑制Bcl-2與Keap1的相互作用，減弱Bcl-2泛素化，增強Bcl-2穩(wěn)定性[40]。

Bcl-2蛋白在腫瘤細胞中的表達大大高于在正常細胞中的表達，也就是說以其為靶點的抑制劑幾乎不會對正常細胞產(chǎn)生影響，通過抑制Bcl-2抗凋亡蛋白來克服肺癌細胞對凋亡的耐受是一種基于腫瘤發(fā)病機制的治療方案，比傳統(tǒng)的細胞毒性療法選擇性好、安全性高[41-42]。目前關(guān)于Bcl-2蛋白的抑制劑也有很多，比如：ABT-737，ABT-263，VENETOCLAX等[43]。除Bcl-2外，針對其他抗凋亡蛋白的小分子抑制劑也在研究中。這類針對抗凋亡蛋白的小分子抑制劑不僅在肺癌的治療中前景巨大，在其他腫瘤的治療中也是一個重要選擇。

肺癌的病因至今仍未能完全的闡明，造成其發(fā)生的危險因素有很多，其中，吸煙是確認的與肺癌發(fā)生有關(guān)系的最重要因素[44]。尼古丁對肺癌治療效果有嚴重的影響，尼古丁及其代謝產(chǎn)物可以通過活化乙酰膽堿受體進而激活下游Src、Ras-Raf-MAPK-MEK和PI3K/AKT信號通路，進一步推動Bcl-2基因家族蛋白的表達。本文主要闡述了尼古丁誘導Bcl-2和Mcl-1磷酸化，磷酸化增強其抗凋亡功能；而對于促凋亡蛋白Bax和Bad的磷酸化，磷酸化使其促凋亡功能失活，這些都有助于增加人類肺癌細胞的生存和化療耐藥性?；谀峁哦cl-2基因家族蛋白的影響的研究，專門針對該蛋白磷酸化的分子抑制劑可以作為肺癌治療的研究對象，為肺癌治療提供一種新的途徑，從而盡可能做到早干預(yù)，抗耐藥，以提高肺癌的治療效果。同時，對于肺癌的所有研究均顯示尼古丁誘導肺癌細胞對化療藥物的耐藥性仍然只是部分的，表明仍有其他因素導致肺癌細胞不斷增殖且對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，發(fā)現(xiàn)并尋找這些因素，并且研究該因素對于細胞內(nèi)部凋亡通路的影響，將對肺癌的臨床治療應(yīng)用具有指導意義。