王晨曦,張谞霄,蒲 娟,孫洪磊

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院， 北京 海淀 100193)

禽流感是由禽流感病毒(AIV)引起的禽類高度接觸性傳染病。根據(jù)該病毒對(duì)雞的致病性，可將其分為低致病性禽流感(LPAI)病毒和高致病性禽流感(HPAI)病毒。目前認(rèn)為，HPAI主要由H5和H7亞型引起[1]。其中H7亞型AIV已在全球多個(gè)地區(qū)中發(fā)現(xiàn)，不僅波及的國(guó)家和地區(qū)較廣，而且暴發(fā)的亞型多樣，對(duì)人類健康也有嚴(yán)重的威脅，特別是新型H7N9流感病毒感染人的報(bào)道更是引發(fā)了人們的廣泛關(guān)注。

根據(jù)血凝素(HA)基因的分子遺傳進(jìn)化特點(diǎn)，H7亞型AIV可以分為歐亞和北美兩個(gè)進(jìn)化分支，我國(guó)自然分離到的H7亞型AIV均屬于歐亞分支[2]。在美國(guó)，LPAI和HPAI H7亞型均在家禽中暴發(fā)，并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，北美分支的H7亞型流感病毒也多次引起人類感染發(fā)病[3-5]。研究表明，與歐亞分支的H7亞型AIV相比，北美分支的H7亞型AIV獲得了更強(qiáng)的α-2,6唾液酸糖苷結(jié)合能力，而α-2,6唾液酸糖苷為人類上呼吸道主要分布的流感病毒受體，因此推測(cè)該類病毒具有更強(qiáng)的跨物種感染能力[6]。同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，部分北美分支H7亞型AIV能夠在哺乳動(dòng)物模型雪貂間發(fā)生有效的接觸傳播，在人際間流行的可能性更大[6]。因此，北美分支H7亞型AIV的公共衛(wèi)生學(xué)意義值得關(guān)注。

截至目前，我國(guó)尚未有人或禽類感染北美H7亞型流感病毒的報(bào)道，但是頻繁的禽產(chǎn)品貿(mào)易交流以及候鳥遷徙都可能將北美源H7亞型AIV傳入我國(guó)。我們之前的研究已經(jīng)建立了針對(duì)北美H7亞型AIV HA基因的RT-PCR檢測(cè)方法，該方法具有良好的特異性和敏感性，適合基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用[7]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)模板的定量，具有特異性好、靈敏度高、結(jié)果直觀、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于流感病毒的檢測(cè)[8-9]。因此，建立北美H7亞型AIV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，能夠?yàn)楸O(jiān)測(cè)北美源H7 亞型AIV入境傳播提供更加準(zhǔn)確、有效的工具。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與病毒 北美H7亞型流感病毒A/New York/107/2003 (H7N2) HA基因質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。A/duck/Anhui/D293/2014 (H3N2)、A/chicken/Shandong/16/05 (H9N2)、新城疫病毒(LaSota) 和雞傳染性支氣管炎病毒(H12) 由本實(shí)驗(yàn)室分離和/或保存。H5N1 AIV、歐亞分支H7N2和H7N9病毒抗原，購(gòu)自哈爾濱維科生物制品有限公司。

1.2 主要試劑 病毒RNA提取試劑盒，購(gòu)自Roche公司；SYBR Green PCR Master Mix，購(gòu)自Applied Biosystems公司；反轉(zhuǎn)錄流感特異性引物為Uni 12 :5′-AGCAAAAGCAGG-3′，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit′，購(gòu)自Promega公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank已發(fā)布的H7亞型AIV血凝素(HA)基因序列，利用MEGA 6和 Primer Premier 5.0針對(duì)北美源H7亞型AIV保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物。引物序列分別為， F:5′-AATCACTAGGAGTCCAGAGTGATGC-3′；R: 5′-AGTTCTAGAGTTGATGTTTTGGAAT-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段115 bp。引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 使用Roche RNA提取試劑盒分別提取H3N2、H5N1、H7N2、H7N9和H9N2亞型流感病毒、新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒的總RNA。按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用于PCR擴(kuò)增。

1.5 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 A/New York/107/2003(H7N2) HA目的基因的PCR擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化和鑒定等均按照常規(guī)方法進(jìn)行。陽(yáng)性重組菌液由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將鑒定正確的陽(yáng)性菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，分光光度計(jì)測(cè)量重組質(zhì)粒濃度，-20 ℃保存。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系 在20 μL反應(yīng)體系中加入 SYBR Green PCR Master Mix (2×)10 μL、引物F 0.5 μL、引物R 0.5 μL、模板2 μL，加雙蒸水至20 μL。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，取1.0×108- 1.0×103Copies/μL作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并設(shè)置陰性對(duì)照NTC。

1.8 特異性試驗(yàn) 用建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法分別對(duì)北美H7N2 AIV HA質(zhì)粒，及歐亞分支H7N2、H7N9、H3N2、H5N1和H9N2流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)置陰性對(duì)照，以評(píng)價(jià)該方法的特異性。

1.9 敏感性試驗(yàn) 將北美H7亞型AIV A/New York/107/2003(H7N2) HA 質(zhì)粒稀釋至5.3×107Copies/μL，再依次進(jìn)行10倍倍比稀釋，作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，評(píng)價(jià)該方法的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋，以6個(gè)不同稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，根據(jù)DNA 拷貝數(shù)和Ct值生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線中Ct值和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA 濃度間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.99，Y=-2.905 log C0+37.406。見(jiàn)中插彩版圖1。

2.2 特異性評(píng)價(jià) 用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)北美H7N2亞型AIV A/New York/107/2003(H7N2) HA質(zhì)粒，及歐亞分支H7N2、H7N9、H3N2、H5N1、H9N2亞型AIV、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)置陰性對(duì)照。結(jié)果表明，針對(duì)北美H7N2禽流感HA質(zhì)粒出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增曲線，其他病毒及陰性對(duì)照均未產(chǎn)生熒光信號(hào)，表明該方法有良好的特異性。見(jiàn)中插彩版圖2。

2.3 敏感性評(píng)價(jià) 以10倍倍比稀釋的北美H7亞型AIV HA 質(zhì)粒作為模板，評(píng)價(jià)該方法的敏感性。結(jié)果顯示，該引物能檢測(cè)出的最低質(zhì)粒濃度為53 Copies/μL。見(jiàn)中插彩版圖3。

3 討論

自2013年中國(guó)發(fā)現(xiàn)了全球首例人感染H7N9病例以來(lái)，我國(guó)每年冬春季都會(huì)出現(xiàn)一波人感染H7N9疫情。2017年H7N9病毒進(jìn)一步發(fā)生變異，部分毒株對(duì)家禽呈現(xiàn)高致病性，而且2016-2017年的第5波疫情較往年出現(xiàn)更早，報(bào)告病例數(shù)顯著增多[10]。同時(shí)，北美源H7N2、H7N3亞型流感病毒也多次引起人類感染發(fā)病，這些均提示我們應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該亞型流感病毒的監(jiān)測(cè)。盡管我國(guó)自然分離到的H7亞型AIV均屬于歐亞分支，但隨著國(guó)際貿(mào)易的增加以及候鳥遷徙帶毒的影響，北美源H7亞型AIV傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)日益增加，因此建立一種針對(duì)北美H7亞型禽流感病毒的快速檢測(cè)方法具有重要意義。

本研究中，我們建立了針對(duì)北美H7亞型AIV HA基因的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。該方法Ct值與DNA濃度間呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，可信度高。此外，該方法僅針對(duì)北美H7亞型AIV HA 基因出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增曲線，而未檢出歐亞分支H7亞型AIV H7N2和H7N9、其他亞型(H3、H5和H9)流感病毒以及新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒。檢測(cè)方法的靈敏度可達(dá)53 Copies/μL，具有良好的特異性、敏感性。

SYBR Green I是一種結(jié)合于雙鏈DNA 小溝中的熒光染料，其熒光強(qiáng)度的增加與雙鏈DNA 的數(shù)量成正比[11]。我們?cè)谥暗难芯恐幸呀?jīng)建立了針對(duì)北美H7亞型AIV HA基因的RT-PCR檢測(cè)方法，該方法適合基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用[7]。傳統(tǒng)的RT-PCR檢測(cè)方法需要通過(guò)核酸電泳進(jìn)行鑒定，整個(gè)過(guò)程至少需要3～4 h才能完成。本研究中通過(guò)SYBR Green I和引物所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，整個(gè)過(guò)程僅耗時(shí)1.5 h，是一種更加簡(jiǎn)潔、快速的檢測(cè)方法。因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件與實(shí)驗(yàn)要求的不同，我們所建立的北美H7亞型AIV HA基因檢測(cè)方法能夠?yàn)楸O(jiān)測(cè)北美源H7 亞型AIV入境傳播提供準(zhǔn)確、有效的工具。