艾菊青，毛浩萍

（天津中醫(yī)藥大學，天津 300193）

骨質(zhì)疏松癥（OP）是以骨量減少、骨組織微細結(jié)構(gòu)退化、破壞，導致骨脆性和骨折危險性增加為特征的一種全身性、代謝性骨骼疾病[1]。年齡逐步增長或女性進入絕經(jīng)期，體內(nèi)性激素水平的驟減、鈣調(diào)節(jié)激素的分泌紊亂及微量元素的攝入不足是導致老年和絕經(jīng)女性原發(fā)性O(shè)P的重要病因。隨著經(jīng)濟的發(fā)展和醫(yī)療技術(shù)的進步，OP治療花費亦在逐年增加。根據(jù)2009年國際骨質(zhì)疏松癥基金會首次在亞洲14個國家開展的骨骼健康狀況和OP的綜合性研究報告指出：至2020年，中國OP或低骨密度患者將達到2.866億人次，而因骨質(zhì)疏松引起的髖部骨折治療經(jīng)費將達到850億元，至2050年患者人數(shù)則將躍升至5.333億；治療經(jīng)費更劇增至1.8萬億元[2]。因此世界衛(wèi)生組織（WHO）將OP列為心血管疾病之后的第二位健康問題，但目前尚未完全闡明OP的發(fā)生機制。間充質(zhì)干細胞（MSCs）是來源中胚層存在于骨髓及多種組織中的多向分化的一類干細胞，可向成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞及神經(jīng)細胞等分化。MSCs符合干細胞所特有的自我更新和多向分化的潛能，又不具有致畸胎瘤的風險，因此MSCs剛被鑒定不久研究者就嘗試利用MSCs移植治療多種疾病[3-5]。多項研究證實，OP的發(fā)生與MSCs向脂肪和成骨分化失衡密切相關(guān)，因此，本文擬圍繞MSCs與OP間的關(guān)系及現(xiàn)存有問題進行綜述，旨在為MSCs移植治療OP提供一定理論依據(jù)。

1 MSCs概述

Friedenstein等[6]最早發(fā)現(xiàn)MSCs是一類存在于骨髓，具有呈纖維樣貼壁非造血細胞。隨后諸多深入實驗表明MSCs呈克隆樣單個核細胞團，具有較強的增殖能力和一定的自我更新能力并有向成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞分化的潛能。MSCs存在多種組織器官中，如骨髓、臍帶血、脂肪、肺、肝及皮膚，但在不同組織中占有比例不同：占骨髓有核細胞的0.001%-0.01%[7]，在羊水中具有較高的比例為0.9%～1.5%[8]。目前并未有公認的MSCs表面分子鑒定金標準，而依據(jù)其來源種屬的不同具有相應(yīng)差異，如來源于人的MSCs表面標記至少應(yīng)該具有Strom-1，CD44，CD71，CD90，CD105 的高表達；源于小鼠的為 Sca-1，CD105，CD140a，CD44 的高表達；造血和內(nèi)皮則標記為陰性，如CD45，CD31，CD34，CD11b，CD79c等[9]。并且多項研究顯示來源于機體不同部位的MSCs，其表面分子表達標記也具有差異性，如來源于脂肪組織的MSCs會高表達CD45，而來源于骨髓的MSCs則高表達CD271，表明MSCs的表面分子表達具有不穩(wěn)定性，這可能與MSCs異質(zhì)性、體外培養(yǎng)時間和代數(shù)等多種原因相關(guān)，同時也需要更多深入的研究來探索和準確的鑒定MSCs表面分子標記。

MSCs作為脂肪細胞和成骨細胞的同源體，當成骨-脂肪間失衡，就能引起OP。研究表明老化促進MSCs向脂肪細胞轉(zhuǎn)化，可能是由于老化引起活性氧簇（ROS）增加，激活過氧化酶體增殖物激活（PPAR）受體，從而導致MSCs向脂肪細胞分化增多，造成成骨-脂肪的失衡[10-11]；李東菊等的研究也證實去勢后大鼠MSCs增殖能力及成骨分化能力減弱，且趨向脂肪細胞進行分化[12]。同時，MSCs可分泌多種生長因子和細胞因子，利于受損組織進行修復，如MSCs通過分泌骨形成蛋白（BMPs）進行軟骨、骨及肌腱等修復[13]。且MSCs的獲得不受倫理限制，也無并發(fā)畸胎瘤等風險，MSCs具有易獲得性及明確的成骨分化能力，均為日后其移植治療骨質(zhì)疏松奠定了基礎(chǔ)。

2 MSCs移植治療OP的可行性

由于MSCs具有廣泛的獲得性并擁有多向分化的潛能，且多項研究表明MSCs能夠在機體組織損傷、生長及愈合中進行替換和更新體內(nèi)細胞。因此，被認為具有較強促再生能力的MSCs在治療OP中具有廣泛的應(yīng)用前景。

2.1單純的MSCs移植治療OP 作為脂肪細胞和成骨細胞的同源體，MSCs數(shù)量的減少或功能的缺損，會直接引起OP，因此，系統(tǒng)或局部移植正常功能的MSCs被認為對治療OP具有一定的療效。

Deepshikha T等[14]研究去勢后大鼠MSCs修復功能，采用流式細胞術(shù)觀察去勢后大鼠MSCs數(shù)量的變化，發(fā)現(xiàn)去勢后大鼠MSCs干細胞表面分子標記CD90和CD54表達率明顯下降，且去勢后大鼠的MSCs更傾向于脂肪細胞分化；而后分別將去勢后大鼠的MSCs及正常大鼠的MSCs移植至骨折大鼠，3 h后采用雙探頭單光子發(fā)射計算機斷層成像術(shù)（SPECT/CT）掃描，結(jié)果顯示，盡管去勢后大鼠的MSCs也具有改善鈣結(jié)合能力及提高骨折區(qū)域骨量的功能，但效果明顯低于正常組的MSCs，且歸巢至骨折區(qū)域去勢大鼠的MSCs明顯少于正常組的MSCs。Jinhui S等[15]分別將1～2月齡的年輕小鼠和20～24月齡自然衰老老年小鼠的BMMSC移植至自然衰老的雌性小鼠中，6個月后發(fā)現(xiàn)移植年輕小鼠MSCs組骨膜有更多的MSCs，且骨鈣素（OC）含量要遠高于老年組，這也證實了老化后MSCs的增殖、歸巢及成骨分化能力均要減弱，另外同時發(fā)現(xiàn)移植至年輕小鼠MSCs組的小鼠平均壽命長于老年組。Dmitriy等首先應(yīng)用脊柱損傷大鼠，并分別采用MSCs移植或PTH注射單治療法或聯(lián)合治療2周，觀察脊柱傷口愈合情況，結(jié)果顯示PTH注射可以提高MSCs遷移至骨折區(qū)，并促進MSCs向成骨細胞分化，從而促進脊柱傷口的愈合。并且為了進一步研究MSCs對脊柱損傷的作用情況，采用豬自分泌的MSCs，對脊柱損傷的小豬進行了同樣的MSCs移植治療，結(jié)果顯示移植后的MSCs具有減緩損傷區(qū)域的骨丟失情況，這些研究結(jié)果表明PTH可能是作為一種黏合劑，從而促進移植MSCs向損傷區(qū)域遷移，并進一步分化為成骨細胞，并阻止骨量丟失。

2.2修飾后MSCs移植治療OP 雖然多項研究證實未經(jīng)任何修飾的MSCs移植雖然能夠駐留于骨，并具有一定增殖能力，且能夠向成骨細胞分化，增加成骨細胞的數(shù)量，因此在一定程度上能夠逆轉(zhuǎn)骨流失，但由于宿體移植后MSCs歸巢數(shù)量少，且駐留時長短等問題，造成MSCs治療療效存有爭議，因此，研究者通過基因修飾MSCs，期望以此提高MSCs治療OP效果。

Yao W等[16]發(fā)現(xiàn)移植單純MSCs僅能在機體停留4～8周，導致MSCs療法效果甚微，因此，為了提高MSCs療效，他們將雙磷酸鹽和MSCs表面高表達的整合素a4β1的擬態(tài)物配體（LL2A）制成混合物后，再與MSC復合后同時靜脈注入去勢小鼠，研究結(jié)果表明相比于單純的MSCs移植，LL2A-Ale與MSCs復合物可通過介導細胞外基質(zhì)促進MSCs的歸巢。Sun WC等[17]采取逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的方法將核因子kB活化因子（RANK-Fc）和（或）趨化因子受體4（CXCR4）整合至MSCs基因組中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靜脈注射至去勢后小鼠體內(nèi)，過表達RANK-Fc和CXCR4的MSCs均可改善去勢后引起的OP，且趨化因子受體CXCR4-MSCs更能提高MSCs的歸巢數(shù)量。

3 MSCs移植治療OP機制研究

3.1MSCs歸巢作用 MSCs的歸巢是OP治療重要環(huán)節(jié)，需要多種趨化因子和蛋白等參與其中，首先，MSCs通過卷曲栓附等形式與內(nèi)皮組織進行接觸，接著在G蛋白耦合因子活化、整合素介導等激活因素下，MSCs穿過內(nèi)皮組織，從而到達基底膜完成歸巢過程[18]。

SDF1/CXCR4被認為是影響MSCs歸巢中最主要的信號通路，基質(zhì)細胞衍生因子（SDF-1）最早被認為由干細胞分泌的可溶性配體，為B祖細胞生長因子[19]，隨著研究的深入，SDF-1并不同于其他炎癥因子誘導的產(chǎn)生趨化因子，它由基質(zhì)細胞持續(xù)產(chǎn)生，并為B淋巴細胞、骨髓髓系細胞及心血管內(nèi)皮細胞等生長所必須的，而CXCR-4是目前已知的SDF-1唯一受體。源于骨髓的MSCs表達CXCR4，當受損組織如心、腦、腎、骨等具有SDF-1高表達，在AKT及P38等信號通路參與下，調(diào)控CXCR-4-MSCs遷移至受損部位[20-22]。

3.2MSCs分泌細胞因子作用 研究顯示當局部多種炎癥因子和缺氧等環(huán)境刺激，MSCs可通過自身及旁分泌多種細胞因子和生長因子促進骨組織再生和修復。Nixon AJ等發(fā)現(xiàn)MSCs移植至宿體后，能夠分泌多種細胞因子如生長轉(zhuǎn)換因子-1（TGF-β1），胰島素樣生長因子（IGF-I和BMP2等），促進軟骨、骨及肌腱等受損組織的修復[9]。同時，外源性的MSCs進入機體后，分泌生長因子激活損傷組織周圍的干細胞，因此當外源性MSCs凋亡或者不再在損傷部位駐留時，依然可以產(chǎn)生顯著的治療效果。不同于MSCs直接分化為成骨細胞，移植至機體的MSCs分泌多種因子，激活和啟動宿主自身的再生過程發(fā)揮著更為廣泛的作用。

3.3與內(nèi)皮細胞共同作用 研究發(fā)現(xiàn)MSCs需要與內(nèi)皮組織接觸后遷移至受損部位，MSCs如何與內(nèi)皮組織作用機制尚未完全明確，有研究[23]顯示腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可激活內(nèi)皮細胞從而提高兩者的結(jié)合，并且在這過程中MSCs會分泌一系列的黏附因子，Steingen C等[24]發(fā)現(xiàn)是內(nèi)皮細胞的經(jīng)典表型，如血管細胞黏附分子-1（VCAM-1），整合素β1和基質(zhì)金屬蛋白2（MMP-2）調(diào)控，如內(nèi)皮細胞表達的VACM-1與MSCs表達的VLA-4結(jié)合后介導MSCs遷移。

4 MSCs移植治療OP存在的問題

盡管MSCs發(fā)現(xiàn)較早，并進行相關(guān)研究多年，且MSCs療法治療多種疾病作用及機制亦得到驗證，然而在追求MSCs療效最優(yōu)化且具較高安全性的同時，控制其適宜注射量、采取恰當?shù)囊浦卜绞郊斑_到優(yōu)化療效的途徑仍是現(xiàn)在亟需廣大研究者解決的問題。

4.1MSCs細胞注射量及注射途徑 目前，MSCs移植治療OP還多停留于動物實驗階段，MSCs細胞治療量暫無統(tǒng)一標準，研究者多采用1～5×106個/kg的細胞數(shù)[25]，且注射途徑也未統(tǒng)一，多數(shù)研究者采用尾靜脈注射的方式。因尾靜脈注射會造成MSCs細胞的丟失，并會促進MSCs向肺臟歸巢，故Shuo H等[26]采用心臟注射方式。Taketoshi K等[27]采用局部注射方法，直接向骨折區(qū)域注射MSCs，認為可以提高MSCs的歸巢數(shù)量，但也有研究認為無論是系統(tǒng)移植還是局部移植，MSCs細胞歸巢的效率并沒有差別。

4.2MSCs體外培養(yǎng)時間及代數(shù)對療效的影響 雖然MSCs存在于機體大部分組織中，但是比例卻非常低，因此體外培養(yǎng)擴增是MSCs治療的前期基礎(chǔ)。而目前尚未對MSCs細胞代數(shù)作統(tǒng)一規(guī)定，研究顯示隨著MSCs體外培養(yǎng)時間的增加，會弱化MSCs的歸巢能力。Rombouts等[28]通過系統(tǒng)移植未在體外培養(yǎng)的EGFP-MSCs至清髓的C57BL/6小鼠中，24 h后發(fā)現(xiàn)有55%～65%MSCs能夠歸巢至骨髓中，說明原代MSCs具有較高的歸巢能力；研究者又分別移植了體外培養(yǎng)24 h和48 h的MSCs至清髓的C57/BL小鼠中，結(jié)果顯示體外培養(yǎng)24 h的MSCs導致MSCs歸巢能力降低至10%，而將MSCs體外培養(yǎng)48 h后，未能在骨髓等造血組織中發(fā)現(xiàn)MSCs，表明MSCs完全丟失了歸巢能力。James DK等[29]取新生6 d小鼠骨髓中MSCs，進行體外成骨誘導培養(yǎng)，應(yīng)用茜素紅染色計算鈣沉積面積比，結(jié)果顯示P1 MSCs誘導的鈣沉積面積比為（46.7±9.0），胞外鈣含量為（0.27±0.06），而到P6時，MSCs誘導的鈣沉積面積比降低至（31.1±10.1），胞外鈣含量為（0.2±0.04），表明隨著MSCs體外培養(yǎng)代數(shù)的增加，其成骨能力會逐漸減弱，但這僅局限于新生小鼠的MSCs，研究者發(fā)現(xiàn)6周和1 a老年的小鼠MSCs并不因為代數(shù)的增加而導致成骨能力降低，這可能與MSCs異質(zhì)性及體外增殖能力有關(guān)。

4.3MSCs細胞歸巢數(shù)量 盡管研究證實自體或異體MSCs系統(tǒng)移植均可改善OP，但多項研究表明移植后由于MSCs歸巢數(shù)量有限及駐留時長問題，導致MSCs治療OP有效率下降。Shuo H等[26]進行系統(tǒng)移植MSC，運用小動物活體成像技術(shù)觀察移植MSCs后不同時間點細胞歸巢數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植1 h后，MSCs基本聚集在肺臟，移植5～8 d后，在骨折區(qū)僅有微弱的MSCs熒光信號，且持續(xù)1～3 d后消失。RE Ploemacher課題組[27]考察體外培養(yǎng)不同時間后MSCs歸巢能力，結(jié)果顯示隨著體外培養(yǎng)時間的增加，MSCs歸巢能力逐漸減弱。針對這些問題，研究人員也在不斷的思考，嘗試各種方法以試圖解決這些阻礙。如對MSCs進行基因修飾，由于CXCR4/SDF-1軸被認為是MSCs歸巢過程最為重要的通路，而MSCs表達CXCR4水平并不高，因此通過轉(zhuǎn)染等技術(shù)使得CXCR4在MSCs中過表達，以此提高MSCs歸巢能力。諸多研究者利用基因修飾技術(shù)進行類似實驗，改造MSCs歸巢相關(guān)的基因，如整合素a4等，希冀提高MSCs歸巢效率，但與此同時，也帶來了免疫反應(yīng)及MSCs增殖能力減弱等問題。

5 小結(jié)

自2004年以來，與MSCs相關(guān)的臨床試驗項目數(shù)量在全球范圍內(nèi)明顯增加，表明MSCs治療方案具有廣泛的應(yīng)用前景，雖然目前仍有許多問題亟需研究者解決，包括如何獲得純度較高的MSCs；如何提高MSCs細胞歸巢數(shù)量，選取合適細胞代數(shù)、細胞數(shù)量及治療時間窗等，但在骨組織再生領(lǐng)域中，MSCs移植治療可作為新策略實現(xiàn)骨組織再生和修復。正如前所述，MSCs移植后可直接增加骨內(nèi)MSCs總數(shù)量，提高成骨分化，更為重要的是可分泌多種趨化因子，這些趨化因子對于OP引發(fā)的骨折具有重要的治療意義，且MSCs治療相對傳統(tǒng)藥物治療具有治療時間短、方式便捷等優(yōu)勢，因此隨著研究者對MSCs認識的不斷深入，目前未釋疑問題將逐步解決，該治療方法因其具有傳統(tǒng)治療方法不可比擬的優(yōu)勢，終將應(yīng)用于OP的臨床治療。

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