王小雙，米艾，孫捷，王丹，曾麗，冉麗媛*，吳英杰*

(1. 大連醫(yī)科大學(xué)重大疾病基因工程模式動物研究所，基因工程模式動物國際聯(lián)合研究中心，遼寧 大連 116044； 2. 吉林大學(xué)附屬第一醫(yī)院干部病房，長春 130000)

1966年，Zvi Laron首次發(fā)現(xiàn)一種常染色體隱性遺傳的侏儒癥并將其命名為Laron綜合征，該類患者身材矮小、青春期延遲、反復(fù)低血糖、低血清胰島素樣生長因子1(IGF-1)、高血清GH；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該疾病是由于GHR基因突變導(dǎo)致GH功能缺陷[1]。但受病例數(shù)量和科研手段限制，這種GH功能缺陷對機體生長代謝的長期影響及相關(guān)疾病治療與預(yù)后均未得到充分研究。

如今，基因編輯技術(shù)在研究疾病發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)歸治療等方面發(fā)揮日益重要的作用?？茖W(xué)家基于Cre/LoxP等技術(shù)建立了多種基因敲除模型以研究特定基因在特定組織或各種疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機制。小鼠Ghr基因由15號染色體上共計10個外顯子編碼[2-3]，其中外顯子4編碼 GH結(jié)合區(qū)，因此也成為Ghr基因編輯的靶標(biāo)。目前除了全身Ghr基因敲除小鼠外，肝、肌肉、脂肪等組織特異性Ghr基因敲除小鼠模型也逐步產(chǎn)生，用于分析GH相關(guān)信號通路在機體生長及代謝中的作用。

1 全身敲除Ghr基因小鼠模型

1997年Zhou等[4]構(gòu)建了第一只全身敲除Ghr基因小鼠模型(GHR-/-)，這是最早用于研究GH功能的實驗動物模型，迄今已發(fā)表相關(guān)論文70余篇。

GHR全身敲除對小鼠生長發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重影響。GHR-/-小鼠生長緩慢，出生時體重與對照組無明顯差異，從3周齡開始，其身長、體重均小于對照組，且隨年齡增長差距越發(fā)明顯[4]。盡管雄性 GHR-/-小鼠體重較低，但其脂肪占比明顯增高，雌性GHR-/-小鼠無此現(xiàn)象[5-6]。隨年齡增加，GHR-/-小鼠(90周齡)體重有所降低[7]，這提示GHR-/-小鼠脂肪占比增加存在性別和年齡依賴。

由于缺少GH刺激和IGF-1負(fù)反饋調(diào)節(jié)，GHR-/-小鼠血清GH顯著增加，血清IGF-1含量減少[4]，血清瘦素[8]及脂聯(lián)素[9]水平均有升高。GHR-/-小鼠胰島素水平較低，但胰島素敏感性增加[5]，血膽固醇及低密度脂蛋白含量低[8]，壽命延長[10-11]。GHR-/-小鼠更容易被高脂飲食(High fat diet，HF)誘導(dǎo)產(chǎn)生肥胖，但胰島素敏感性仍優(yōu)于對照組[12]。這表明，當(dāng)脂肪組織充分發(fā)揮儲脂功能時，肥胖對機體健康的損傷可能有所下降，也說明體內(nèi)脂質(zhì)含量不應(yīng)是衡量健康與否的核心標(biāo)準(zhǔn)。

與Laron綜合癥患者相似，GHR-/-小鼠性成熟較晚，生育能力降低[13-14]，平均每胎生仔2.71只，僅 GHR+/-小鼠的1/3(6.57只/胎)，且死亡率較高，這可能與胎盤功能和哺乳能力不足有關(guān)[4]。GHR-/-小鼠在生長發(fā)育、生殖及代謝方面的改變可為臨床探究GH功能失調(diào)相關(guān)疾病提供充足的理論依據(jù)。

2 肝特異性敲除Ghr基因小鼠模型

Fan等[15]在2009年構(gòu)建了一種GHR-Flox小鼠，并與Alb-Cre工具鼠雜交獲得肝特異性敲除ghr小鼠模型(GHRLD)。GHRLD小鼠血清IGF-1減少了95%，且伴隨嚴(yán)重高GH血癥(升高4倍)；但在幾乎完全缺失內(nèi)分泌 IGF-1的情況下，其身長體重并未受影響，僅出現(xiàn)肝重顯著增加而腎重減少。肝特異性敲除Igf-1也會導(dǎo)致高 GH血癥及血漿中IGF-1水平下降，但對小鼠生長并無顯著影響[16-18]，這說明肝源性 IGF-1并非小鼠生長所必需，循環(huán)中高水平GH與GHR的直接作用或機體其他組織通過自分泌、旁分泌產(chǎn)生的少量 IGF-1才是機體生長的關(guān)鍵。另外，GHRLD小鼠6周齡時即出現(xiàn)葡萄糖耐量異常和胰島素抵抗(IR)，8周齡時自發(fā)形成脂肪肝[15]，說明肝GHR可能參與介導(dǎo)了GH非IGF-1依賴性的胰島素分泌及糖脂代謝調(diào)節(jié)。

2014年， List等[19]將 Alb-Cre工具鼠與其新構(gòu)建的 GHR-Flox小鼠雜交獲得新型肝特異性敲除Ghr小鼠模型(LiGHRKO)。與GHRLD小鼠不同，LiGHRKO小鼠脂肪減少，肝重增加，身長體重均明顯低于對照組。其中，雄性 LiGHRKO小鼠出現(xiàn)脂肪肝，而雌性小鼠肝無明顯變化。值得注意的是，在轉(zhuǎn)錄水平， LiGHRKO小鼠除了肝中Igf-1表達(dá)明顯降低外，其余組織中Igf-1表達(dá)均明顯升高[19]。由此可見，肝作為循環(huán)內(nèi)IGF-1的最大來源，其GHR缺失嚴(yán)重影響 GH依賴于 IGF-1的生長發(fā)育、血糖調(diào)節(jié)及肝脂質(zhì)代謝過程。非酒精性脂肪肝(NAFLD)作為代謝綜合征累及肝的病理表現(xiàn)，影響著全球三分之一的人群。據(jù)研究，GH受損人群NAFLD發(fā)病率更高[20]。循環(huán)水平低GH或肝GH/IGF-1軸功能受損均與 NAFLD發(fā)生相關(guān)。上述兩種模型為深入認(rèn)識 NAFLD發(fā)病機制及其臨床個性化靶向治療提供了良好的實驗工具。

3 骨骼肌特異性敲除Ghr基因小鼠模型

Mavalli等[21]在2010年構(gòu)建了骨骼肌特異性敲除Ghr小鼠模型(ΔGHR)。骨骼肌Ghr缺失導(dǎo)致骨骼肌纖維比例顯著失調(diào)，Ⅰ型肌纖維明顯減少，Ⅱ型肌纖維明顯增多，骨骼肌肌核減少，肌力降低并產(chǎn)生胰島素抵抗[21]。同時，缺失Ghr的肌原細(xì)胞內(nèi)磷酸化的胰島素底物1表達(dá)上調(diào)，磷脂酰肌醇激酶及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的磷酸化水平均顯著下調(diào)，這揭示了ΔGHR小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗的機制。

同肝Ghr敲除小鼠模型類似，肌肉敲除Ghr對小鼠生理代謝的影響也因Cre鼠的不同而各有差異。利用Mef-2c-73k-Cre構(gòu)建的ΔGHR小鼠脂肪增多導(dǎo)致體重增加，且產(chǎn)生高血糖和高血脂[21]；而利用 MCK-Cre構(gòu)建的mGHRKO小鼠則恰好相反，表現(xiàn)為消瘦、更優(yōu)的胰島素敏感性和糖耐量[22]。HF喂養(yǎng)后，mGHRKO小鼠脂肪肝病變較輕，胰島素敏感性較好，骨骼肌攝糖量及氧化呼吸率增加。HF處理的mGHRKO小鼠蛋白激酶 B磷酸化水平上調(diào)，這可能是其對胰島素更敏感的原因[22]。2015年， List等[23]利用 Ckmm-Cre鼠獲得新型骨骼肌和心肌特異性敲除Ghr小鼠模型(MuGHRKO)。研究發(fā)現(xiàn)雄性 MuGHRKO小鼠體重與脂肪重量均略有增加，血糖與血胰島素水平較低；而雌性MuGHRKO小鼠體重與脂肪組織重量則顯著減輕[23]。這與LiGHRKO小鼠肝脂肪變性僅限于雄性小鼠的發(fā)現(xiàn)類似[19]，提示Ghr基因在不同性別中的表達(dá)及GH在不同組織的功能發(fā)揮具有二態(tài)性，從而對GH的臨床研究及應(yīng)用起到一定指導(dǎo)作用。

4 脂肪特異性敲除Ghr基因小鼠模型

List等[24]在2013年利用aP2-Cre與 GHR-Flox小鼠雜交獲得脂肪特異性敲除Ghr基因小鼠模型(FaGHRKO)。FaGHRKO小鼠除了肥胖和脂肪明顯增多外，在血糖、胰島素、葡萄糖耐量、胰島素敏感性及脂肪細(xì)胞因子水平并無明顯改變。有研究報道Ap2基因不僅表達(dá)于脂肪組織，在非脂肪組織如心臟內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼肌周圍毛細(xì)血管、巨噬細(xì)胞和胚胎發(fā)育過程中亦有表達(dá)[25]，這種非特異性表達(dá)可能對實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾。

脂肪組織不僅是機體重要的儲能和內(nèi)分泌器官，也是間充質(zhì)干細(xì)胞的最大來源，探索GH對脂肪的調(diào)控和脂肪源性干細(xì)胞增殖分化能力的影響可為臨床干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和移植提供新思路。Adipoq-Cre是另一種在脂肪組織中特異表達(dá) CRE酶的工具鼠。相較于ap2-Cre，其介導(dǎo)的基因重組更加特異[26]。利用Adipoq-Cre構(gòu)建新型脂肪特異性敲除Ghr小鼠模型，探索 GH相關(guān)信號通路對脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)合成分解等代謝過程的調(diào)控及其與肥胖癥、脂肪肝等脂代謝紊亂疾病的關(guān)系是很有必要的。

5 巨噬細(xì)胞特異性敲除Ghr基因小鼠模型

肥胖常伴有脂肪組織中巨噬細(xì)胞(Mφ)的浸潤、積累和激活[27]。研究表明，在含有Mφ的條件培養(yǎng)液中培養(yǎng)前脂肪細(xì)胞，其成脂分化能力更強，過氧化物酶體增殖物激活受體γ的轉(zhuǎn)錄水平升高，且Mφ這種促分化作用必須在 GH刺激下才能發(fā)生[28]。為了探索 GH對Mφ分泌因子的直接作用和對飲食誘導(dǎo)肥胖的影響，2010年 Lu等[29]將LysM-Cre鼠與Ghr-Flox小鼠雜交，獲得Mφ敲除Ghr小鼠模型(MacGhrKO)。 HF處理8周，MacGhrKO小鼠產(chǎn)生明顯的糖耐量異常， HF處理18周，MacGhrKO小鼠糖耐量損傷更明顯，并產(chǎn)生了胰島素抵抗。同時， MacGhrKO小鼠脂肪組織內(nèi)胰島素信號通路也被顯著抑制[29]。

Mφ在脂肪組織中有M1和M2兩種表型，其中M1數(shù)量增加與炎癥發(fā)生密切相關(guān)。在肥胖患者脂肪中存在大量Mφ浸潤并高表達(dá)M1標(biāo)記物，分泌促炎細(xì)胞因子[30]。HF 處理18周后， MacGhrKO小鼠脂肪內(nèi) Mφ總數(shù)增加，M1比例升高且炎癥因子表達(dá)顯著增多。這表明在 HF條件下，Mφ缺失GH作用會導(dǎo)致脂肪組織中Mφ浸潤增加和明顯的炎癥反應(yīng)[29]。該模型證實GH參與肥胖與慢性炎癥的發(fā)生機制。

6 β細(xì)胞特異性敲除Ghr基因小鼠模型

2011年， Wu等[31]利用 RIP-Cre鼠構(gòu)建了β細(xì)胞特異性敲除Ghr基因小鼠模型(βGhrKO)。盡管Ghr全身敲除導(dǎo)致胰島細(xì)胞顯著變小[5]，但β細(xì)胞內(nèi)敲除Ghr后對小鼠胰島大小和胰島素含量并無明顯影響；HF處理24周后βGhrKO小鼠出現(xiàn)糖耐受不良及葡萄糖刺激的胰島素分泌不足，組織免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)其胰島細(xì)胞增殖明顯降低，這可能與細(xì)胞周期蛋白D2表達(dá)量降低有關(guān)[31]。

7 結(jié)語

GH相關(guān)信號通路在機體生長發(fā)育、糖脂代謝、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用[32-35]。上述多種Ghr基因敲除小鼠模型是深入研究GH生理病理功能的良好工具。臨床GH功能缺陷可發(fā)生于嬰幼兒、兒童直至成年期的不同階段，所引起或參與的代謝紊亂與發(fā)病年齡密切相關(guān)，導(dǎo)致的癥狀、對生長代謝的影響亦大不相同。不同時期發(fā)病的患者對環(huán)境及飲食因素的易感性也不盡相同[36]。兒童期 GH缺乏多由相關(guān)基因缺陷引起，如Laron綜合征，對機體生長發(fā)育影響重大；而成人階段GH功能紊亂隱匿且復(fù)雜，可與糖尿病、肥胖癥、肝疾病及其他激素紊亂互為因果，也可與藥物、創(chuàng)傷等外界因素相關(guān)[37]。因此，利用Ghr基因敲除小鼠模型解析GH對生長代謝的作用時，除了考慮組織特異性外，激素功能發(fā)生紊亂的時段特異性也尤為重要。

利用Cre-LoxP技術(shù)與時間特異性可誘導(dǎo)的基因敲除手段相結(jié)合，可使我們對體內(nèi)特定基因或基因組合的認(rèn)識增加另一個維度。可誘導(dǎo)性基因敲除手段包括：他莫昔芬、四環(huán)素等配體誘導(dǎo)[38-39]；表達(dá)CRE的腺病毒或慢病毒載體注射進(jìn)行體外傳送[40]、 RNAi介導(dǎo)[41]，以及由植物光感受器發(fā)展而來的光波誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)相互控制[42]，從而達(dá)到DNA重組的目的。該類技術(shù)已在越來越多的全身或組織特異性基因敲除中得以實踐，如心臟[43-44]、腎[45]、腦[42]中特異性敲除基因等。已有報道成功構(gòu)建出他莫昔芬誘導(dǎo)的心臟特異性Ghr敲除小鼠模型(iC-GHRKO)[39]，以研究不同生長階段 GHR缺失的作用。故而開發(fā)可控、可逆轉(zhuǎn)的定時、定點、定系(細(xì)胞譜系)的Ghr敲除小鼠模型，無疑是未來深入探索 GH/GHR功能機制的必然方向。

另一方面，和許多其他激素相似， GH對生長發(fā)育和機體代謝的調(diào)控功能發(fā)揮具有脈沖式分泌、性別二態(tài)性和晝夜節(jié)律等特點，在對此類模型研究結(jié)果的解讀中不可忽視。另外，不同哺乳動物物種的代謝特征與其身體大小密切相關(guān)，因此，在對比基因敲除小鼠模型和臨床觀察結(jié)果時，有必要納入分析因素。