滕飛翔，沈之君，趙洪俠，張棟梁，楊留才△

(1.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，江蘇鹽城 224005；2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系，江蘇南通 226001；3.濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部，山東濰坊 261041)

鎂離子(Mg2+)是一種對(duì)心肌細(xì)胞生命活動(dòng)有重要影響的二價(jià)陽(yáng)離子，其具有舒緩血管平滑肌、改善缺血心肌的能量代謝、糾正缺血心肌的不應(yīng)期等作用[1]。當(dāng)Mg2+代謝失衡時(shí)，會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)心力衰竭、心房顫動(dòng)、心律不齊、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等癥狀[2-6]。有研究表明，Mg2+進(jìn)出細(xì)胞會(huì)通過離子通道或轉(zhuǎn)運(yùn)體等來實(shí)現(xiàn)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)Mg2+的通道或轉(zhuǎn)運(yùn)體，普遍存在于哺乳動(dòng)物的各組織和器官內(nèi)[7-11]。

鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(magnesium transporter 1，MagT1)存在于哺乳動(dòng)物的多種細(xì)胞內(nèi)，含有335個(gè)氨基酸[12]。GOYTAIN等[12]研究顯示MagT1是一種特異性的Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)體。ZHOU等[13]實(shí)驗(yàn)表明MagT1在維持細(xì)胞內(nèi)外Mg2+穩(wěn)態(tài)中起非常重要作用。還有研究表明，MagT1通過調(diào)節(jié)Mg2+的轉(zhuǎn)運(yùn)，影響多種組織和器官，對(duì)骨細(xì)胞分化、骨整合、癌細(xì)胞診斷、妊娠胎盤和胚胎發(fā)育起到重要作用，還會(huì)導(dǎo)致XMEN綜合征、免疫缺陷相關(guān)疾病等[14-22]。

目前MagT1的相關(guān)研究較少，本研究應(yīng)用 RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)，體外合成siRNA并轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞，沉默心肌細(xì)胞內(nèi)的MagT1，觀察其對(duì)胞內(nèi)Mg2+濃度和心肌細(xì)胞生存及正常生命活動(dòng)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1 d齡SD大鼠(南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)和南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)10只，雌雄不限。

1.2試劑 DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自日本Nissui pharmaceutical公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hycolone公司；siRNA序列購(gòu)自上海吉瑪公司；Trypsine、Trizol、LipofectamineTMRNAiMAX、熒光二抗購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Ⅱ型膠原酶購(gòu)自美國(guó)GIB- CO公司；Taq DNA 聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；MagT1兔抗購(gòu)自北京奧維亞公司；α-actin鼠抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin V-FITC)0凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biouniquer公司。

1.3儀器 PCR 擴(kuò)增儀(美國(guó) Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠，型號(hào) DYY-Ⅲ2 型)；DYCp-31D 型水平電泳槽(北京市六一儀器廠)；高速低溫離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf公司)；常溫離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf公司)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司，型號(hào)GHP-9080)；微量移液器(德國(guó) Gilson公司)；pH計(jì)(上海雷磁)；正置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司，型號(hào)BX51)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó) Thermo公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)。

1.4方法

1.4.1大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 10只1 d齡的普通級(jí)SD大鼠，無菌條件下剪取心臟，使用D-Hanks液漂洗3次。在小培養(yǎng)皿中剪下心尖(心室肌)部分，把心尖部分剪碎至1～2 mm3碎塊。將碎塊置于小瓶中加入0.08%胰酶+Ⅱ型膠原酶混合液，置于37℃水浴恒溫振蕩儀中反應(yīng)10 min，棄去上清液；沉淀部分重復(fù)上述步驟，反應(yīng)后反復(fù)吹打沉淀，把渾濁的液體吸出置于離心管中，加含15%血清的DMEM培養(yǎng)液終止胰酶消化，以1 000 r/min的速度離心10 min，棄去上層液體后加入含15%血清的DMEM培養(yǎng)液重懸沉淀中的細(xì)胞，放于培養(yǎng)瓶中置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中1.5 h，進(jìn)行差速貼壁[23]。 隨后以105/mL的密度種于6孔板中，24 h后更換培養(yǎng)基，加0.01 mmol/L的5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)[24]抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。將細(xì)胞懸液與1%的臺(tái)盼藍(lán)溶液1∶1混合進(jìn)行存活度計(jì)數(shù)，被染色的代表死細(xì)胞。培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞中?；煊谐衫w維細(xì)胞，本研究選擇一種心肌細(xì)胞具有但成纖維細(xì)胞沒有的α-actin蛋白一抗[25]進(jìn)行免疫熒光反應(yīng)，以鑒定心肌細(xì)胞的純度。

1.4.2siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞 本研究委托上海吉瑪公司設(shè)計(jì)生產(chǎn)4對(duì)MagT1 siRNA和1對(duì)陰性對(duì)照siRNA，本課題組前期的研究[26]篩選出沉默效果最好的1對(duì)siRNA(序列為5′-GAU UGG ACU UGU UGU GUU ATT-3′，5′-UAA CAC AAC AAG UCC AAU CTT-3′)，陰性對(duì)照siRNA序列為5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT -3′。本研究設(shè)空白對(duì)照組、陰性siRNA組、siRNA組。使用LipofectamineTM RNAiMAX試劑，按照說明書要求將siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)大鼠心肌細(xì)胞。

1.4.3反轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測(cè)MagT1 mRNA表達(dá) Trizol法提取大鼠心肌組織總RNA，使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)總RNA條帶的完整性。使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNAOD260/280吸光度比值(比值大于1.8為合格)，并計(jì)算總RNA濃度。按照反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒操作說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，以人β-actin為內(nèi)參，MagT1引物序列為5′-GAA GCA GCC AAG CAC AGT TTG TAG-3′，5′-CAA TAT CCA TGT CAG AGG CAG CA-3′ ；β-actin引物序列為5′-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TC CTA-3′，5′-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3′。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計(jì)30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后使用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)結(jié)果。本研究使用反轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測(cè)0 d(剛出生)、21 d(哺乳期結(jié)束)和63 d(性成熟)3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的大鼠心肌細(xì)胞中MagT1的mRNA表達(dá)水平，使用反轉(zhuǎn)錄RCR方法對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染48和60 h的大鼠心肌細(xì)胞MagT1 mRNA沉默效率進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.4Western blot方法檢測(cè)MagT1蛋白質(zhì)表達(dá) 使用1 mL組織裂解液作用于100 mg大鼠心肌組織，取得總蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。按5∶1比例混入6倍濃度的上樣緩沖液，煮沸5 min使蛋白質(zhì)變性，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(5%濃縮膠，電壓80 V，時(shí)間1 h；12%分離膠，電壓120 V，直至電泳結(jié)束)。蛋白質(zhì)分離后，使用180 mA轉(zhuǎn)膜2 h，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至 PVDF膜上。膜置于Western封閉液(3% BSA TBST中)中處理1 h，然后置于純化的一抗稀釋液(1∶1 000)中室溫孵育2 h或4 ℃過夜。TBST清洗后，將膜置于二抗稀釋液(1∶3 000)中，室溫孵育1 h。使用X光片取得印跡結(jié)果，并采用Quantity One 掃描軟件分析相對(duì)灰度值。本研究使用Western blot方法對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染48和60 h的大鼠心肌細(xì)胞MagT1蛋白質(zhì)沉默效率進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.5Mag-indo-1檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)Mg2+濃度變化 Mag-indo-1是一種特異性的Mg2+熒光探針，可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Mg2+濃度變化。6孔板中用蓋玻片進(jìn)行心肌細(xì)胞爬片，24 h后轉(zhuǎn)染MagT1 siRNA，過48 h或60 h向含蓋玻片孔中加入Mag-indo-1和D-Hanks混合液，然后放于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。將蓋玻片倒置放于滴好甘油的載玻片上，在熒光顯微鏡下拍照，最后使用Image J軟件對(duì)細(xì)胞熒光照片進(jìn)行半定量分析。本研究使用Mag-indo-1免疫熒光方法對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染48和60 h后的大鼠心肌細(xì)胞Mg2+濃度進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 使用AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒對(duì)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行染色，使用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。貼壁心肌細(xì)胞用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶收集；用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次(2 000 r/min離心5 min)收集(1～5)×105個(gè)細(xì)胞；加入500 μL的Annexin Ⅴ Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻避光、室溫反應(yīng)10 min；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(Ex=488 nm；Em=530 nm)細(xì)胞凋亡情況。本研究使用流式細(xì)胞法對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染48和60 h后的大鼠心肌細(xì)胞細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

A：大鼠心肌細(xì)胞;B：大鼠心肌細(xì)胞α-actin蛋白質(zhì)免疫熒光;C：大鼠心肌細(xì)胞DAPI免疫熒光

圖1大鼠心肌細(xì)胞免疫熒光圖

2.1大鼠心肌細(xì)胞存活度、形態(tài)和純度檢測(cè) 點(diǎn)數(shù)400個(gè)細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，染色細(xì)胞數(shù)量為31個(gè)，細(xì)胞存活率為92.25%(369/400)。細(xì)胞未貼壁時(shí)呈圓形。2 h后細(xì)胞開始貼壁，初期呈梭形，之后進(jìn)行舒展。24 h后全部貼壁，呈梭形、菱形或多角形，大部分進(jìn)行搏動(dòng)。72 h后形成細(xì)胞簇，搏動(dòng)同步化，每分鐘65～85次。心肌細(xì)胞純度免疫反應(yīng)結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞呈綠色熒光，成纖維細(xì)胞無熒光，見圖1。在熒光顯微鏡下點(diǎn)數(shù)染色的細(xì)胞，計(jì)算純度。選取了10個(gè)不同視野，每個(gè)視野點(diǎn)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。而2 000個(gè)細(xì)胞中被染色的細(xì)胞有1 932個(gè)，即心肌細(xì)胞純度為96.60%(1 932/2 000)。

2.2不同時(shí)期大鼠心肌細(xì)胞MagT1 mRNA表達(dá)情況 0、21和63 d大鼠心肌細(xì)胞中MagT1 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

2.3siRNA沉默大鼠心肌細(xì)胞MagT1并檢測(cè)沉默效率 siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞48 h后，MagT1 mRNA的沉默效率為51.83%，MagT1蛋白質(zhì)的沉默效率為56.75%。轉(zhuǎn)染60 h后，MagT1 mRNA的沉默效率為86.91%，MagT1蛋白質(zhì)的沉默效率為83.85%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

2.4大鼠心肌細(xì)胞MagT1沉默后細(xì)胞內(nèi)Mg2+濃度檢測(cè) siRNA轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞48和60 h后，胞內(nèi)Mg2+濃度分別降低29.13%和41.32%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

A：大鼠心肌細(xì)胞MagT1 mRNA 的反轉(zhuǎn)錄PCR分析;B：大鼠心肌細(xì)胞MagT1 mRNA 表達(dá)

圖2 0、21、63 d大鼠心肌細(xì)胞MagT1 mRNA的表達(dá)情況

A：轉(zhuǎn)染48 h；B：轉(zhuǎn)染60 h；1：MagT1 mRNA沉默情況；2：MagT1蛋白質(zhì)沉默情況；a:P<0.05；b:P<0.01

圖3 siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞48和60 h后的MagT1 mRNA和蛋白質(zhì)沉默效率

2.5大鼠心肌細(xì)胞MagT1沉默后細(xì)胞凋亡檢測(cè) siRNA轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞48 h后，空白對(duì)照組和陰性siRNA組的細(xì)胞凋亡率分別是2.86%和3.09%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而siRNA組的細(xì)胞凋亡率(31.18%)比陰性siRNA組顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。siRNA組細(xì)胞的密度和體積小于空白對(duì)照組和陰性siRNA組，折光性降低，偽足變細(xì)，搏動(dòng)節(jié)律降為每分鐘30～50次，見圖6。

siRNA轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞60 h后，空白對(duì)照組和陰性siRNA組的細(xì)胞凋亡率分別是5.77%和5.48%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而siRNA組的細(xì)胞凋亡率(40.61%)比陰性siRNA組顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。另外siRNA組細(xì)胞的密度和體積更小，結(jié)構(gòu)更緊密，搏動(dòng)節(jié)律降為每分鐘20～30次，見圖6。

a:P<0.05,b:P<0.01

圖4 siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞48和60 h后細(xì)胞內(nèi)Mg2+濃度變化

a:P<0.05；b:P<0.01

圖5 siRNA轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞48和60 h后的凋亡檢測(cè)圖

圖6 siRNA轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞48和60 h后的細(xì)胞形態(tài)圖

3 討 論

與其他原代大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法[27-28]相比，從新生乳大鼠、清洗液種類、胰酶濃度、膠原酶配比組成、胎牛血清濃度和細(xì)胞混液離心時(shí)間等方面進(jìn)行輕微改良，得到了存活率和純度高、生命活動(dòng)強(qiáng)的細(xì)胞。在不同發(fā)育時(shí)期的大鼠心肌細(xì)胞中，MagT1表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明MagT1有可能在心肌細(xì)胞起著穩(wěn)定而重要作用。

本研究設(shè)計(jì)并合成了MagT1 siRNA后，先經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)，選出沉默效果最好的1對(duì)siRNA[25]。根據(jù)siRNA說明書和其他研究情況，選取了轉(zhuǎn)染48和60 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行MagT1的沉默情況檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染48 h后心肌細(xì)胞MagT1蛋白質(zhì)被沉默了56.75%，而60 h后MagT1蛋白質(zhì)被沉默了83.85%，達(dá)到了預(yù)定的目標(biāo)，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。

ZHOU等[13]使用siRNA顯著降低HEK-293T細(xì)胞中MagT1表達(dá)水平，當(dāng)胞外具有相同的Mg2+濃度(10 mmol/L)時(shí)，MagT1 siRNA處理過的細(xì)胞中游離Mg2+濃度會(huì)比陰性siRNA對(duì)照組減少50%～60%。本研究與ZHOU等[13]結(jié)果相似，發(fā)現(xiàn)顯著沉默MagT1后，大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)的Mg2+濃度顯著降低。TASHIRO等[29]使用缺鎂食物喂養(yǎng)大鼠4～6周后，與對(duì)照組相比，缺鎂大鼠血清Mg2+總濃度顯著降低，心室肌細(xì)胞膜上包括MagT1在內(nèi)的5種Mg2+通道或轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)都有所上調(diào)，使心室肌細(xì)胞內(nèi)Mg2+濃度無顯著降低。本課題組與TASHIRO等[29]研究結(jié)果共同說明MagT1在維持心肌細(xì)胞內(nèi)Mg2+穩(wěn)態(tài)起著重要作用。

以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究中，MagT1蛋白質(zhì)表達(dá)顯著下降，會(huì)影響胚胎細(xì)胞的正常功能及生存[13]。與ZHOU等[13]結(jié)果相似，本研究發(fā)現(xiàn)大鼠心肌細(xì)胞中的MagT1被顯著沉默后，細(xì)胞凋亡率顯著升高，細(xì)胞形態(tài)和搏動(dòng)也出現(xiàn)了異常，說明MagT1對(duì)心肌細(xì)胞的生存與正常生命活動(dòng)產(chǎn)生了很大影響。推測(cè)這種現(xiàn)象可能是由于MagT1被顯著下調(diào)，導(dǎo)致大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)的Mg2+濃度顯著降低，從而導(dǎo)致細(xì)胞的生存與正常生命活動(dòng)被影響，這有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，siRNA有效沉默大鼠心肌細(xì)胞MagT1，使細(xì)胞內(nèi)Mg2+濃度顯著下降、細(xì)胞凋亡率顯著上升，對(duì)細(xì)胞生存和正常生命活動(dòng)有較大影響為今后探索心肌細(xì)胞內(nèi)Mg2+濃度變化與凋亡的關(guān)系和MagT1沉默誘導(dǎo)的心肌凋亡機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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