吉晟男， 肖能文， 鄧懷慶， 胡德夫

(1. 中國環(huán)境科學(xué)研究院生物多樣性研究中心，北京100012； 2. 貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽550001；3.北京林業(yè)大學(xué)自然保護區(qū)學(xué)院，北京100083)

高溫通常被認為是一種不利的脅迫因子，會影響動物的生存活動(Farooqetal.，2010)。高溫應(yīng)激會影響反芻動物的生長和繁殖(La Sallesetal.，2017)。溫度變化在動物的耐受范圍內(nèi)時，動物可通過自身生理或行為的改變進行體溫調(diào)節(jié)，以適應(yīng)不良的生活環(huán)境(Bernabuccietal.，2010)；當(dāng)溫度變化超過了動物的耐受范圍，動物生理或免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)失常，嚴重的或死亡(Serbesteretal.，2005；Bohmanova，2006)。已有的高溫應(yīng)激研究主要在經(jīng)濟動物中，如綿羊Ovisaries、奶牛Bostaurus等(何世山，金小軍，2003；Renaudeauetal.，2008；Serbesteretal.，2012)；對野生動物的研究，僅見夏季高溫條件下生理狀況的簡單描述(Huberetal.，2003；Gesquiereetal.，2008)。

激素調(diào)節(jié)在動物應(yīng)對高溫時起著非常重要的作用，尤其是糖皮質(zhì)激素和三碘甲腺原氨酸(T3)(Maraietal.，2007；Renaudeauetal.，2008)。短期應(yīng)激對動物有利，但長期的激素應(yīng)激可能會損害動物的健康(Sapolsky，1998)。目前可以通過測定糖皮質(zhì)激素和T3各自的代謝產(chǎn)物在血液、唾液和身體排泄物(如糞便)中的含量來判斷動物的應(yīng)激狀況(Renaudeauetal.，2008)。在血液和唾液的采集過程中，對動物重復(fù)的捕捉和保定不可避免(Millspaugh & Washburn，2004)，對大型哺乳動物和瀕危物種而言難度較大。糞便相對容易采集且不會過度干預(yù)動物的行為，研究者可在遠處觀察目標(biāo)動物，待其排便離開后再采集。這種非損傷性取樣方法在野生動物研究中已得到了廣泛應(yīng)用(Creeletal.，2002；Keechetal.，2010；Dengetal.，2014)。

普氏野馬Equusprezwalskii是世界上僅存的野生馬種類，其野生種群在20世紀(jì)中期于中國和蒙古野外滅絕(Mohr，1971)，但其圈養(yǎng)種群使得這一物種得到保存(Ryder，1994)。在國際保護組織的努力下，普氏野馬圈養(yǎng)種群獲得了充足的發(fā)展，并嘗試放歸實驗以恢復(fù)野生種群(Ryder & Wedermeyer，1982)。中國于1985年在新疆維吾爾自治區(qū)籌建了第一個普氏野馬繁育中心，分別在德國和英國進行引種培育，由于該地歷史上曾經(jīng)有野生種群分布，環(huán)境條件適宜，新疆普氏野馬繁育中心在社會和政府的共同努力下，圈養(yǎng)種群繁育狀況良好，種群數(shù)量不斷擴大，并成功放歸。新疆普氏野馬繁育中心位于中國西北部，冬寒夏熱，四季分明，最熱月(7月)氣溫可達50 ℃(陳金良，2008)。普氏野馬不可避免受到夏季高溫的影響，在此極端條件下，普氏野馬會產(chǎn)生怎樣的生理應(yīng)答未見報道。高溫對圈養(yǎng)普氏野馬生理和行為產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)可能會影響其管護工作。鑒于此，本研究利用非損傷性取樣法對普氏野馬夏季高溫刺激的生理應(yīng)答進行了監(jiān)測，以期為科學(xué)的保護管理提供基礎(chǔ)資料。

1 研究方法

1.1 研究對象

選擇新疆普氏野馬繁育中心(89°14′～89°36′E，45°49′～46°04′N)5個家族群中的15匹成年個體，分為雄馬、雌馬和帶駒雌馬3組，每組5匹(表1)。研究時間為2011年7月4日—8月3日。采用隔日取樣法收集目標(biāo)個體的糞便樣品，如果遇到極端高溫，則每天持續(xù)采樣，待高溫天氣結(jié)束后3～4 d，恢復(fù)隔日取樣法。為排除激素代謝產(chǎn)物水平的時間差異，所有待測樣品均于同一時間段(08∶00—10∶00)采集。在整個取樣期間，不改變普氏野馬的飼喂方式。

表1 實驗個體組別及年齡Table 1 Information of captive Equus prezwalskiiin the experiment

1.2 溫濕度指數(shù)

在飼養(yǎng)場中1.5 m處懸掛干濕溫度計，從08∶00開始，每隔1 h記錄一次溫濕度。利用每天最高溫度和最低相對濕度計算溫濕度指數(shù)(temperature-humidity index，THI)：

THI=db-[(0.31-0.31RH)(db-14.4)]

其中，db為溫度(℃)，RH為相對濕度(%)。當(dāng)THI>28.9時，動物為高溫應(yīng)激狀態(tài)(LPHSI，1990；Maraietal.，2001)。

1.3 樣品采集及檢測

跟蹤觀察目標(biāo)個體，待其排便離開后，用一次性塑料手套收集糞樣上層新鮮部分，混合后用塑料自封袋保存，在袋上標(biāo)記采集時間及個體，帶回基地后放于-20 ℃的冰箱內(nèi)保存待測(Cavigelli，1999；Curtisetal.，2000)。

樣品激素測定參照M?stl等(1999)和Galama等(2004)的方法并略作改進。首先解凍樣品，然后取濕糞10 g進行冷凍干燥，取0.5 g干燥樣品粉碎后放于10 mL 80%甲醇中萃取，離心后取上清液，同時對剩余沉淀物進行二次萃取，離心后取上清液。合并2次收集的上清液進行水浴蒸干，用1 mL 80%甲醇溶解剩余固體并于-20 ℃保存。

采用放射性免疫法測定激素代謝產(chǎn)物水平。皮質(zhì)醇及T3試劑盒(北京北方生物所)主要技術(shù)參數(shù)見表2。N-682型放射性免疫γ光子計數(shù)器(上海核福光電儀器有限公司)測定激素代謝產(chǎn)物水平，測定結(jié)果換算成單位干糞的激素水平(ng·g-1)。普氏野馬糞便激素水平平均具有24 h的延遲(曹婷婷，2008)，數(shù)據(jù)分析時，當(dāng)日糞便激素水平對應(yīng)為前日采集日期。

表2 試劑盒主要技術(shù)參數(shù)Table 2 Technical parameters of the kits

1.4 數(shù)據(jù)檢驗

運用SPSS 23.0(SPSS Inc.，Chicago，USA)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。THI作為分類變量(THI>28.9為高溫應(yīng)激；THI≤28.9為非高溫應(yīng)激)，整合不同類群普氏野馬的糖皮質(zhì)激素代謝產(chǎn)物(fecal glucocorticoid metabolites，F(xiàn)GM)水平與T3代謝產(chǎn)物水平，同一類群當(dāng)日糞便激素取均值對應(yīng)前一天的THI。對比同一類群高溫與非高溫應(yīng)激狀態(tài)下的激素差異，以及不同類群間激素水平差異。使用One Sample Kolmogorov-Smirnov Test對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗，多因變量一般線性模型(Multivariate tests of general linear model)做多因素方差分析，組別和應(yīng)激程度作為固定因子，組間多重比較采用LSD，對比前檢驗數(shù)據(jù)方差齊性。數(shù)據(jù)結(jié)果以Mean±SE表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 夏季普氏野馬總體激素水平

繁育中心夏季炎熱干旱，夏季每日最高溫度和最低相對濕度幾乎同時出現(xiàn)，一般出現(xiàn)在每日的13∶00—18∶00，持續(xù)時間相對較長(圖1)。在整個夏季高溫期，普氏野馬都維持在一個較高的激素水平，F(xiàn)GM水平為161.30～237.19 ng·g-1，T3代謝產(chǎn)物水平為11.64～17.65 ng·g-1。

2.2 夏季高溫期普氏野馬FGM水平

圈養(yǎng)普氏野馬在夏季高溫期不同類群的FGM水平具有明顯差異(圖2)，雄馬組水平最高，為237.19 ng·g-1±10.24 ng·g-1；雌馬組水平居中，為208.34 ng·g-1±6.39 ng·g-1；帶駒雌馬組水平最低，僅為161.30 ng·g-1±5.01 ng·g-1。對3個不同類群的FGM水平進行多因素方差分析，結(jié)果表明，3組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F2， 60=22.885，P<0.001)，具體為：雄馬vs.雌馬(MD=28.855，SE=11.163，P=0.012)、雄馬vs.帶駒雌馬(MD=75.899，SE=11.163，P<0.001)、雌馬vs.帶駒雌馬(MD=47.045，SE=11.163，P<0.001)。此外，以THI=28.9為界，將普氏野馬各組組內(nèi)高溫應(yīng)激與非高溫應(yīng)激的FGM水平進行對比，多因素方差分析結(jié)果顯示，3組組內(nèi)不同應(yīng)激程度的FGM水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F1， 60=0.233，P=0.631)，且組別與應(yīng)激程度不存在交互作用(F2， 60=0.024，P=0.976)。

圖1 夏季高溫期日最高溫度、最低相對濕度及溫濕度指數(shù)Fig. 1 Daily maximum temperature， minimal relative humidity and temperature-humidity index during high temperature periods in summer

圖2 圈養(yǎng)普氏野馬不同類群夏季高溫期糞便糖皮質(zhì)激素代謝產(chǎn)物水平Fig.2 Fecal glucocorticoid metabolites of Equus przewalskii in different groups during high temperature periods in summer

2.3 夏季高溫期普氏野馬T3代謝產(chǎn)物水平

圈養(yǎng)普氏野馬不同類群在夏季高溫期間T3代謝產(chǎn)物水平具有明顯差異(圖3)，雌馬組水平最高，為17.65 ng·g-1±0.59 ng·g-1，雄馬組居中，為14.76 ng·g-1±0.43 ng·g-1，帶駒雌馬組最低，僅為11.64 ng·g-1±0.33 ng·g-1。對3個不同類群的T3代謝產(chǎn)物水平進行多因素方差分析，結(jié)果表明，3組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F2， 60=37.780，P<0.001)，具體為：雄馬vs.雌馬(MD=-2.891，SE=0.662，P<0.001)、雄馬vs.帶駒雌馬(MD=3.120，SE=0.662，P<0.001)、雌馬vs.帶駒雌馬(MD=6.011，SE=0.662，P<0.001)。此外，以THI=28.9為界，將普氏野馬各組組內(nèi)高溫應(yīng)激與非高溫應(yīng)激的T3代謝產(chǎn)物水平進行對比，多因素方差分析結(jié)果顯示，3組組內(nèi)不同應(yīng)激程度的T3代謝產(chǎn)物水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F1， 60=0.333，P=0.566)，且組別與應(yīng)激程度不存在交互作用(F2， 60=2.260，P=0.113)。

圖3 圈養(yǎng)普氏野馬不同類群夏季高溫期三碘甲腺原氨酸代謝產(chǎn)物水平
Fig.3 Fecal thyroid triiodothyronine metabolites ofEquusprzewalskiiin different groups during high temperature periods in summer

3 討論

極端溫度會影響動物生理狀況，動物亦可通過自身生理調(diào)節(jié)以適應(yīng)不良生活環(huán)境(Bernabuccietal.，2010)。新疆屬于中國西北干旱地區(qū)，夏季炎熱，7月為當(dāng)?shù)叵募靖邷仄?陳金良，2008)，在此期間，普氏野馬肯定會受到高溫脅迫。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，普氏野馬在整個高溫期一直維持在較高的FGM和T3水平，遠高于冬季圈養(yǎng)雄馬的FGM水平(34.00 ng·g-1±5.14 ng·g-1)(曹婷婷等，2009)。但是，普氏野馬在夏季高溫期不同溫度下，生理應(yīng)激程度的激素水平差異并不顯著，因此推測，新疆普氏野馬在應(yīng)對夏季高溫脅迫時，其生理代謝水平會升高，并維持較高水平，但在其正常調(diào)節(jié)范圍內(nèi)，沒有超過其耐受的閾值。普氏野馬生理代謝水平的升高可能是其抵御不利環(huán)境的必要保證(于小杰，2011；吉晟男，2013)。此外，LPHSI(1990)僅對畜禽類的高溫應(yīng)激閾值給出統(tǒng)一值，即當(dāng)THI>28.9時，畜禽類動物處于嚴重高溫應(yīng)激狀態(tài)，并未針對動物個體大小進一步細分。Marai等(2001)將THI=28.9作為高溫閾值，應(yīng)用于雌性穴兔Oryctolaguscuniculus的研究中，然而，將THI=28.9作為圈養(yǎng)普氏野馬高溫與非高溫的分界值還有待驗證。

動物身體的核心溫度超過正常范圍時，會導(dǎo)致身體總熱負荷(內(nèi)環(huán)境)超過散熱能力，動物會通過生理或行為方式降低這種反應(yīng)(Bernabuccietal.，2010)。已有研究發(fā)現(xiàn)，圈養(yǎng)普氏野馬在其他季節(jié)的休息時間和飲水頻次顯著低于夏季，且休息和飲水行為發(fā)生高峰期與夏季高溫時間一致(陳金良，2008；張峰，2010)。吉晟男等(2013)的研究表明，夏季高溫期普氏野馬偏好選擇迎風(fēng)背陰處站立休息，且飲水和排尿次數(shù)增多；同時圈舍面積較小、缺乏足夠的庇蔭場所，為爭奪較好的庇蔭環(huán)境，普氏野馬的攻擊行為會增加。

本文研究結(jié)果顯示，圈養(yǎng)普氏野馬的FGM和T3代謝產(chǎn)物在夏季高溫期一直維持較高水平，不同類群間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，總體上成年雄性及雌性的應(yīng)激水平高于帶駒雌馬。這一結(jié)果也許不僅與性別或帶駒有關(guān)， 3組野馬間的年齡差異也可能影響結(jié)果，需要后續(xù)驗證。此外，在干旱地區(qū)，高溫往往與干旱同時共存，水資源的缺乏對野生動物生存影響更大(Krausman & Etchberger，1995；Maraietal.，2007)。陳金良(2008)研究發(fā)現(xiàn)，在新疆普氏野馬繁育中心的圈舍內(nèi)缺乏大面積的地表積水，不利于普氏野馬伏水降溫。Marai等(2010)研究表明，野生水牛Bubalusarneearnee只有在樹蔭下或水中，并有風(fēng)的情況下，體溫才能保持正常。鑒于此，為減少群內(nèi)個體的爭斗，增加其個體生存的適宜度，建議夏季高溫期實行分組、分圈管護，優(yōu)化圈舍環(huán)境，增大圈舍內(nèi)積水面積，具體措施為：(1)分組、分圈管護，將帶駒雌馬和幼駒分離出家族群，合圈飼養(yǎng)。(2)搭建簡易遮陽棚，挖掘小面積水池，增設(shè)飲水槽，增加圈舍內(nèi)積水面積和供水次數(shù)；降低水源因子的限制。(3)圈舍間設(shè)置障礙物，避免普氏野馬之間相互干擾和攻擊。

采用非損傷性取樣法對普氏野馬FGM和T3代謝產(chǎn)物水平進行監(jiān)測，可定量評估圈養(yǎng)普氏野馬夏季高溫期的生理狀況，及時調(diào)整圈養(yǎng)種群的管護模式，降低高溫對普氏野馬的生理及行為影響，為該物種的管護提供數(shù)據(jù)資料。

曹婷婷. 2008. 圈養(yǎng)和放歸普氏野馬應(yīng)激水平的非損傷性研究[D]. 北京： 北京林業(yè)大學(xué).

曹婷婷， 胡德夫， 于小杰， 等. 2009. 冬季圈養(yǎng)和放歸普氏野馬成年雄性應(yīng)激狀態(tài)研究[J]. 干旱區(qū)研究， 26(2)： 234-237.

陳金良. 2008. 放歸普氏野馬的食物、水源、空間利用及生存對策的研究[D]. 北京： 北京林業(yè)大學(xué).

何世山， 金小軍. 2003. 高溫對肉雞血液生化指標(biāo)的影響[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版)， 29(3)： 311-314.

吉晟男. 2013. 圈養(yǎng)普氏野馬(Equusferusprzewalskii)行為與生理生態(tài)及適應(yīng)性的非損傷性研究[D]. 北京： 北京林業(yè)大學(xué).

吉晟男， 楊亮亮， 葛興芳， 等. 2013. 圈養(yǎng)普氏野馬夏季高溫期晝間活動時間分配研究[J]. 四川動物， 32(5)： 676-683.

于小杰. 2011. 大熊貓和普氏野馬類固醇激素及免疫球蛋白水平的非損傷研究[D]. 北京： 北京林業(yè)大學(xué).

張峰. 2010. 普氏野馬行為節(jié)律及其影響因子研究[D]. 北京： 北京林業(yè)大學(xué).

Bernabucci U， Lacetera N， Baumgard LH，etal. 2010. Metabolic and hormonal acclimation to heat stress in domesticated ruminants[J]. Animal， 4(7)： 1167-1183.

Bohmanova J. 2006. Studies on genetics of heat stress in US Holsteins [D]. Athens， Georgia： The University of Georgia.

Cavigelli S. 1999. Behavioural patterns associated with faecal cortisol levels in free-ranging female ring-tailed lemurs (Lemurcatta)[J]. Animal Behaviour， 57(4)： 935-944.

Creel S， Fox JE， Hardy A，etal. 2002. Snow mobile activity and glucocorticoid stress responses in wolves and elk[J]. Conservation Biology， 16(3)： 809-814.

Curtis DJ， Zaramody A， Green DI，etal. 2000. Non-invasive monitoring of reproductive status in wild mongoose lemurs (Eulemurmongoz)[J]. Reproduction， Fertility and Development， 12(2)： 21-29.

Deng HQ， Jin XL， Hu DF，etal. 2014. Fecal cortisol content of wild giant pandas (Ailuropodamelanoleuca) to monitor human disturbance level in natural habitats[J]. Animal Biology， 64(1)： 75-86.

Farooq U， Samad HA， Shehzad F，etal. 2010. Physiological responses of cattle to heat stress[J]. World Applied Sciences Journal， 8(special issue)： 38-43.

Galama WT， Graham LH， Savage A. 2004. Comparison of fecal storage methods for steroid analysis in black rhinoceroses (Dicerosbicornis)[J]. Zoo Biology， 23(4)： 291-300.

Gesquiere LR， Khan M， Shek L，etal. 2008. Coping with a challenging environment： effects of seasonal variability and reproductive status on glucocorticoid concentrations of female baboons (Papiocynocephalus)[J]. Hormones and Behavior， 54(3)： 410-416.

Huber S， Palme R， Arnold W. 2003. Effects of season， sex， and sample collection on concentrations of fecal cortisol metabolites in red deer (Cervuselaphus)[J]. General and Comparative Endocrinology， 130(1)： 48-54.

Keech AL， Rosen DA， Booth RK，etal. 2010. Fecal triiodothyronine and thyroxine concentrations change in response to thyroid stimulation in Steller sea lions (Eumetopiasjubatus)[J]. General and Comparative Endocrinology， 166(1)： 180-185.

Krausman PR， Etchberger RC. 1995. Response of desert ungulates to a water project in Arizona[J]. The Journal of Wildlife Management， 59： 292-300.

La Salles AYF， Batista LF， Souza BB，etal. 2017. Growth and reproduction hormones of ruminants subjected to heat stress[J]. Journal of Animal Behaviour & Biometeorology， 5(1)： 7-12.

Livestock and Poultry Heat Stress Indices (LPHSI). 1990. Agricultural engineering technology guide[S]. Clemson (SC)： Clemson University.

Marai IFM， Ayyat MS， Abd El-Monem UM. 2001. Growth performance and reproductive traits at first parity of New Zealand white female rabbits as affected by heat stress and its alleviation under Egyptian conditions[J]. Tropical Animal Health and Production， 33(6)： 451-462.

Marai IFM， El-Darawany AA， Fadiel A，etal. 2007. Physiological traits as affected by heat stress in sheep-a review[J]. Small Ruminant Research， 71(1)： 1-12.

Marai IFM， Haeeb AAM. 2010. Buffalo’s biological functions as affected by heat stress-a review[J]. Livestock Science， 127： 89-109.

Millspaugh JJ， Washburn BE. 2004. Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research： considerations for application and interpretation[J]. General and Comparative Endocrinology， 138(3)： 189-199.

Mohr E. 1971. The Asiatic wild horse[M]. London： JA Allen & Co. Ltd.

M?stl E， Messmann S， Bagu E，etal. 1999. Measurement of glucocorticoid metabolite concentrations in faeces of domestic livestock[J]. Transboundary and Emerging Diseases， 46(10)： 621-631.

Renaudeau D， Kerdoncuff M， Anais C，etal. 2008. Effect of temperature level on thermal acclimation in large white growing pigs[J]. Animal， 2(11)： 1619-1626.

Ryder OA， Wedermeyer E. 1982. A cooperative breeding programme for the Mongolian wild horseEquusprzewalskiiin the United States[J]. Biological Conservation， 22(4)： 259-271.

Ryder OA. 1994. Genetic studies of Przewalski’s horses and their impact on conservation[M]// Boyd L， Houpt KA. Przewalski’s horse： the history and biology of an endangered species. New York： Albany： 75-92.

Sapolsky RM. 1998. Why zebras don’t get ulcers： an updated guide to stress， stress-related diseases， and coping[M]. New York： WH Freeman and Company.

Serbester U， Gorgiilii M， Kutlu HR，etal. 2005. The effects of sprinkler+fan，sh meal or dietary fat on milk yield and milk composition of dairy cows in mid lactation during summer[J]. Journal of Animal and Feed Sciences， 14： 639-653.