夏志遠(yuǎn)，王兆雷，曹 源，李 波，莫耀南

腐敗尸體死亡時(shí)間(postmortem interval，PMI)推斷是法醫(yī)實(shí)際工作中經(jīng)常遇到的問題，然而依據(jù)尸體現(xiàn)象等傳統(tǒng)方法推斷PMI，所得結(jié)果誤差較大。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用各種精密儀器分析尸體組織內(nèi)各種物質(zhì)的時(shí)序性變化規(guī)律，已經(jīng)成為當(dāng)前PMI推斷研究的重要手段之一。本文主要就光譜分析法、色譜分析法、電化學(xué)分析法等儀器分析方法在法醫(yī)腐敗尸體PMI推斷研究所取得的進(jìn)展加以綜述，對(duì)未來的研究方向提供了一些參考性建議。

1 推斷PMI的方法進(jìn)展

1.1傳統(tǒng)方法(經(jīng)驗(yàn)分析法)

依據(jù)經(jīng)驗(yàn)分析尸體腐敗程度進(jìn)而推斷腐敗尸體的PMI是法醫(yī)實(shí)踐中廣泛應(yīng)用的方法。目前認(rèn)為，對(duì)腐敗尸體進(jìn)行準(zhǔn)確的PMI推斷，需要滿足以下兩個(gè)基本條件。首先，需要對(duì)尸體的腐敗程度進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定；第二，需要建立尸體腐敗程度與腐敗影響因素之間的量化模型或數(shù)學(xué)模型[1-7]。在過去幾十年里，國(guó)內(nèi)外學(xué)者就上述兩個(gè)問題進(jìn)行了大量的研究，已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。最早用于評(píng)價(jià)尸體腐敗程度的方法為腐敗五分期法，即新鮮期(fresh)，腐敗膨脹期(float)，腐敗活躍期(active decay)，腐敗后期(advanced decay)和殘骸期或干燥期(remains/dry)。隨著尸體腐敗分期在實(shí)踐中大量應(yīng)用的同時(shí)，該法的有關(guān)缺陷也逐漸被發(fā)現(xiàn)。首先，該法每個(gè)時(shí)期之間的界限不明顯；其次，該方法忽略了尸體腐敗是一個(gè)連續(xù)的過程這一本質(zhì)問題。為此，有學(xué)者在尸體腐敗分期基礎(chǔ)上，通過增加更多的腐敗細(xì)節(jié)，用以提高腐敗分期法的連續(xù)性。目前，受國(guó)際關(guān)注的典型方法有全身腐敗積分法(total body score, TBS)[5]以及基于腐敗百分?jǐn)?shù)所建立起來的腐敗通用方程(universal decompositional formula)[8]等。這些方法對(duì)于腐敗尸體的PMI推斷具有重要意義，目前腐敗程度的評(píng)價(jià)已經(jīng)開始由定性向定量的方向發(fā)展。然而，一些學(xué)者提出，上述方法也存在一定的局限，例如該法雖然以量化的形式對(duì)尸體腐敗程度進(jìn)行評(píng)估，但該法依然存在較大的主觀性和經(jīng)驗(yàn)性。

1.2推斷PMI的新技術(shù)(儀器分析法)

自20世紀(jì)30年代后期儀器分析的問世以來，分析化學(xué)領(lǐng)域的檢測(cè)手段發(fā)生了革命性的變化。而隨著“轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)”思路在法醫(yī)研究領(lǐng)域的不斷滲透，借鑒分析化學(xué)領(lǐng)域中光譜分析法、色譜分析法、質(zhì)譜分析法、電化學(xué)分析法等儀器分析方法檢測(cè)人體死后各種化學(xué)成分的時(shí)間依賴性變化規(guī)律，已經(jīng)成為研究法醫(yī)腐敗尸體PMI研究的重要手段，并且取得了一定的進(jìn)展。

1.2.1光譜分析法

光譜分析法(spectrum analysis)是利用光譜學(xué)的原理和實(shí)驗(yàn)方法以確定物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分的分析方法，如紫外—可見吸收光譜法、紅外光譜法等，具有靈敏、快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。目前，光譜分析法已經(jīng)應(yīng)用于許多領(lǐng)域的研究，而對(duì)于尸體腐敗組織內(nèi)一些物質(zhì)的含量分析也有一定的價(jià)值。

劉倩等[9]在20 ℃恒溫條件下研究了大鼠肌肉、肝臟、腎臟等臟器腐敗含氮產(chǎn)物三甲胺(trimethylamine, TMA)含量與PMI的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠死后3種組織內(nèi)TMA含量隨PMI有所增加，其中肝、腎組織TMA變化一致，肌肉在3～8 d內(nèi)擬合較好y=0.509x3-9.153x2+55.727x-95.819 (R2=0.953)，其中x表述PMI，y表述TMA。與肝、腎組織不同，肌肉在2～7 d內(nèi)擬合較好y=-0.457x3+6.519x2-24.574x+27.207(R2=0.969)，其中x表述PMI，y表述TMA。

我國(guó)學(xué)者利用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)(fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR)分析尸體腐敗后組織內(nèi)各種物質(zhì)變化與PMI關(guān)系的研究數(shù)量較多。研究表明，20 ℃下，大鼠組織與人體離體組織FTIR光譜吸收峰變化相似，均經(jīng)歷增強(qiáng)、下降、穩(wěn)定3個(gè)時(shí)期。此外，心臟、肺、骨骼肌變化較肝、脾、腎組織變化明顯，且4 d后變化依然存在。因此，利用FTIR技術(shù)分析心、肺、骨骼肌組織的光譜變化，對(duì)于腐敗尸體PMI推斷意義更大[10]。

也有學(xué)者[11-12]利用顯微拉曼光譜(raman spectra)技術(shù)分析了脾、肝、腎組織隨PMI的改變，研究表明，3種組織的激光拉曼光譜特征峰均隨PMI延長(zhǎng)而減小，且與PMI關(guān)系顯著。

1.2.2色譜分析法

色譜分析法(chromatography)是分析化學(xué)中常用的分離與分析技術(shù)。隨著氣相色譜儀器、液相色譜儀等大型精密儀器的研發(fā)和使用，對(duì)于尸體腐敗后各種有機(jī)復(fù)雜組分進(jìn)行高效地分離、定性、定量已經(jīng)成為可能，因而色譜分析技術(shù)也可為腐敗尸體PMI推斷的有關(guān)研究提供重要手段。

尸體組織內(nèi)氨基酸分解將產(chǎn)生大量腐敗胺，而腐敗胺的變化與PMI存在一定的相關(guān)性。張艷林等[13]利用反相高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測(cè)了大鼠死后組織色胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺7種生物胺。研究結(jié)果表明7種生物胺在0.5～100.0 μg·mL-1范圍具有良好線性關(guān)系，檢出限為0.14～0.50 μg·mL-1,回收率為83.8%～100.6%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<11%。HPLC檢測(cè)尸體組織胺類物質(zhì)，操作過程相對(duì)復(fù)雜，而可以為PMI推斷指標(biāo)的篩選提供技術(shù)手段。

尸體腐敗后，將產(chǎn)生大量腐敗揮發(fā)性氣體(volatile organic compounds，VOCs)，而VOCs的種類和含量變化規(guī)律與PMI也存在一定的相關(guān)性。劉蓓蓓等[14]，利用頂空固相微萃取(HS-SPME)與氣相色譜—質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)分析了25 ℃下大鼠死后肌肉VOCs成分與PMI的關(guān)系。研究結(jié)果表明，隨著PMI的延長(zhǎng)，VOCs種類逐漸增加：1 d沒有檢測(cè)到VOCs，2 d檢出3種，3 d檢出9種，4 d檢出11種，5～7 d檢出14種，8～10 d出15種。VOCs總峰面積與PMI關(guān)系顯著：2～5 d，回歸方程為y=-17.05x2+164.36x-246.36 (adj.R2=0.96)；6～10 d回歸方程為y=2.24x+101.13 (adj.R2=0.97)。尸體組織VOC測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便快速，可以作為PMI研究的新方法。

1.2.3電化學(xué)分析法

電化學(xué)分析法(electrochemical analysis)是化學(xué)儀器分析的重要組成部分，總體而言，電化學(xué)分析具有靈敏性高、準(zhǔn)確性高、測(cè)量范圍廣、儀器便于攜帶等優(yōu)勢(shì)。而利用電化學(xué)分析法進(jìn)行PMI推斷的研究也取得了一定的進(jìn)展。

尸體死后化學(xué)變化中，伴有大量氧化還原反應(yīng)，而氧化還原電位(oxidation reduction potential，ORP)可以反映液體物質(zhì)中宏觀氧化—還原性的大小。楊天潼等[15]初步研究了不同溫度下離體家兔心血ORP值與放置時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果表明，不同溫度下家兔心血ORP值變化均與放置時(shí)間顯著相關(guān)(R2=0.972～0.986)，且保存溫度越高，ORP值增加越迅速。此外，該研究中所建立的ORP、溫度、放置時(shí)間之間的三圍曲面回歸方程，對(duì)于多溫度下腐敗尸體PMI推斷的研究提供了新的擬合方法。

揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen，TVB-N)是蛋白質(zhì)在細(xì)菌作用下所產(chǎn)生的堿性含氮物質(zhì)的總和。TVB-N可以客觀反映肉類新鮮程度或腐敗程度，為我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)。本組前期研究首次將TVB-N用于尸體組織腐敗程度的研究，并建立了與法醫(yī)尸體研究相適應(yīng)的TVB-N電導(dǎo)滴定測(cè)定法[16]。在25 ℃下大鼠死后13 d內(nèi)肌肉TVB-N與PMI存在高度相關(guān)性。TVB-N在1 d內(nèi)變化不明顯，2～13 d顯著增加，TVB-N與PMI關(guān)系擬合較好，y= 3.35×10-5x3-2.17×10-2x2+6.13x-85.82 (adj.R2=0.985)，其中x表示PMI，y表示TVB-N。食品科學(xué)TVB-N向法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的轉(zhuǎn)化與借鑒，為尸體腐敗程度測(cè)定及腐敗尸體PMI推斷的研究提供了基本方法。

而隨著尸體的腐敗，尸體組織內(nèi)細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)液外流，有機(jī)大分子物質(zhì)逐漸分解成具有導(dǎo)電性質(zhì)的小分子物質(zhì)，因此尸體組織電導(dǎo)率(electrical conductivity，EC)與PMI也存在一定的關(guān)系。有學(xué)者[17-18]研究了20 ℃左右和28 ℃左右下，尸體肌肉EC隨PMI的變化，研究結(jié)果表明，尸體肌肉組織EC隨PMI呈現(xiàn)階段性變化，即穩(wěn)定期、快速上漲期、減速上漲期，肌肉電導(dǎo)率隨PMI變化結(jié)果與法醫(yī)尸體腐敗發(fā)展過程基本一致。進(jìn)一步研究表明，大鼠死后肌肉EC與TVB-N呈現(xiàn)顯著直線正相關(guān)，這一結(jié)果表明EC可以作為尸體組織腐敗程度評(píng)價(jià)的快速實(shí)用指標(biāo)。此外，有學(xué)者還比較了25 ℃下，大鼠死后肌肉浸漬液EC、pH隨PMI的變化規(guī)律，結(jié)果顯示[19]，1 d內(nèi)pH顯著下降，而pH變化不明顯；2～3 d，EC、pH均顯著增大，4～10 d，EC繼續(xù)增加，而pH變化不明顯。將EC、pH兩指標(biāo)聯(lián)用可以擴(kuò)大PMI推斷的適用范圍，亦可以作為PMI研究的方法。

1.2.4其他方法

除上述方法外，利用磁共振技術(shù)[20]、X光技術(shù)[21]、電阻抗技術(shù)[22]等儀器分析技術(shù)也取得了一定的進(jìn)展。

2 當(dāng)前研究方法面臨的挑戰(zhàn)

晚期尸體PMI推斷被譽(yù)為法醫(yī)病理學(xué)研究領(lǐng)域的癌癥。隨著各種其他科學(xué)領(lǐng)域檢測(cè)方法的轉(zhuǎn)化和應(yīng)用，當(dāng)前晚期尸體PMI在研究方法得到了有效擴(kuò)充。但無(wú)論是光譜分析、色譜質(zhì)譜分析和電化學(xué)分析，實(shí)現(xiàn)腐敗尸體PMI的準(zhǔn)確推斷，目前依然存在很大挑戰(zhàn)。而引起腐敗尸體PMI推斷困難的原因有多個(gè)方面，作者從幾個(gè)角度分析如下。

2.1研究對(duì)象的復(fù)雜性

主要體現(xiàn)在人體內(nèi)所含化學(xué)物質(zhì)種類多樣，相同個(gè)體在不同時(shí)期呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)改變，而不同個(gè)體之間差異更大，因此不同個(gè)體死后腐敗變化規(guī)律也呈現(xiàn)一定差異。其中，腸道菌群是引起尸體腐敗的重要因素，而研究表明，隨著個(gè)體年齡的改變，其體內(nèi)腸道菌群也隨之發(fā)生變化，這可能是引起不同年齡個(gè)體腐敗規(guī)律的差異的原因之一。此外，個(gè)體的體型、性別、疾病等差異亦可能造成個(gè)體之間腐敗規(guī)律的不同。光譜分析、色譜質(zhì)譜分析和電化學(xué)分析等PMI推斷研究方法，雖然能夠?qū)κw局部組織的生化成分進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，但無(wú)法對(duì)個(gè)體間差異做進(jìn)一步解釋和區(qū)分。

2.2影響因素的多樣性

研究表明，除個(gè)體之間存在變異之外，尸體腐敗發(fā)生發(fā)展受多種因素的影響，如溫度、濕度、氧分壓、動(dòng)物破壞、昆蟲、衣著、藥物、死因、埋藏地點(diǎn)等。而當(dāng)前PMI的研究多限于實(shí)驗(yàn)條件，其涉及影響因素相對(duì)單一，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果難以滿足復(fù)雜多變的實(shí)際環(huán)境。此外，光譜分析、色譜質(zhì)譜分析和電化學(xué)分析等推斷PMI的研究方法，本質(zhì)上利用了尸體組織微觀化學(xué)反應(yīng)模型，其推斷結(jié)果的準(zhǔn)確性有賴于尸體具體局部組織的底物含量和動(dòng)態(tài)反應(yīng)條件決定。而在PMI推斷實(shí)踐過程，難以精確獲取上述全部有效信息。

2.3理論研究與系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)的匱乏性

到目前為止，國(guó)內(nèi)外利用各種精密檢測(cè)儀器已經(jīng)找出大量與PMI相關(guān)的指標(biāo)，然而尚沒有發(fā)現(xiàn)任何一個(gè)指標(biāo)可以單獨(dú)用于PMI的準(zhǔn)確推斷。因此，有學(xué)者認(rèn)為建立多指標(biāo)、多因素的PMI推斷模型是實(shí)現(xiàn)PMI準(zhǔn)確推斷的重要途徑。然而，對(duì)于如何建立這一模型，目前缺乏確切的理論模型。此外，我國(guó)目前尚未建立完善的死亡管理制度，由此帶來的尸檢率低、尸體數(shù)據(jù)采集困難等問題，將直接制約著我國(guó)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)的有序進(jìn)行和尸體大數(shù)據(jù)的分析。

3 解決途徑與研究方法

鑒于以上問題，作者認(rèn)為未來腐敗尸體PMI研究，可以從推斷模型的建立、研究方案的擬定、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的收集等方向開展。

首先，應(yīng)完善PMI推斷有關(guān)理論的研究，建立以“概率論”為理論指導(dǎo)的PMI推斷模型。準(zhǔn)確腐敗PMI的推斷有賴于對(duì)尸體自身特點(diǎn)以及尸體腐敗動(dòng)態(tài)過程有關(guān)事實(shí)的認(rèn)定。然而，“證據(jù)之境”原理表明，依據(jù)證據(jù)所推理出來的事實(shí)是一種概率性事實(shí)，具有發(fā)生錯(cuò)誤的可能性。而PMI推斷中涉及的指標(biāo)、影響因素與證據(jù)的作用相似，依據(jù)指標(biāo)、影響因素所推斷出來的PMI結(jié)果也應(yīng)是一種概率性的事實(shí)，因此也存在發(fā)生錯(cuò)誤的可能。因此，以“概率論”為理論指導(dǎo)的多指標(biāo)、多因素的PMI推斷模型，不僅有利于進(jìn)一步對(duì)PMI推斷過程的本質(zhì)屬性的理解，也有利于PMI推斷結(jié)果的正確評(píng)價(jià)與使用。

其次，擬定系統(tǒng)、統(tǒng)一的研究方案，開展多校長(zhǎng)期合作的研究項(xiàng)目。我國(guó)是PMI研究的大國(guó)，研究方法涉及光譜分析、色譜質(zhì)譜分析、電化學(xué)分析、昆蟲學(xué)方法、核酸蛋白質(zhì)分析等多個(gè)領(lǐng)域，研究地點(diǎn)比較集中(主要在高校)，因此我國(guó)在PMI推斷的研究上具有一定的優(yōu)勢(shì)。因此，不同PMI研究領(lǐng)域相互合作，擬定系統(tǒng)、統(tǒng)一的研究方案，不僅有利于不同技術(shù)理論間的相互滲透，同時(shí)還可以促進(jìn)不同方法的比較與改進(jìn)，為進(jìn)一步PMI優(yōu)秀指標(biāo)的篩選以及多指標(biāo)推斷模型的建立奠定方法基礎(chǔ)。

最后，健全我國(guó)死亡管理制度，建立我國(guó)不同地區(qū)PMI推斷數(shù)據(jù)庫(kù)。我國(guó)是世界人口大國(guó)，據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)管理局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，我國(guó)近5 a平均人口死亡率約為7.14‰，平均死亡人口數(shù)約為972萬(wàn)。建立完善的死亡管理制度，不僅可以為整個(gè)醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供動(dòng)力，而且可以為PMI推斷的研究提供可靠大數(shù)據(jù)。在大數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，分別建立適用于不同地區(qū)、不同氣候的PMI推斷數(shù)據(jù)庫(kù)，有望為腐敗尸體PMI推斷的研究帶來突破性進(jìn)展。

參考文獻(xiàn)：

[1] Henssge C,Madea B.Estimation of the time since death[J].Forensic Sci Int,2007,165(2):182-184.

[2] Lynch-Aird J,Moffatt C,Simmons T.Decomposition Rate and Pattern in Hanging Pigs[J].J Forensic Sci,2015,60(5):1155-1163.

[3] Carter DO,Yellowlees D,Tibbett M.Temperature affects microbial decomposition of cadavers ( Rattus rattus ) in contrasting soils[J].Appl Soil Ecol,2008,40(1):129-137.

[4] Myburgh J,L’Abbé EN,Steyn M,et al.Estimating the postmortem interval (PMI) using accumulated degree-days (ADD) in a temperate region of South Africa.[J].Forensic Sci Int,2013,229(1-3):165.e1-165.e6.

[5] Knobel Z,Ueland M,Nizio KD,et al.A comparison of human and pig decomposition rates and odour profiles in an Australian environment[J].Aust J Forensic Sci,2018,(1):1-16.

[6] Myburgh J,L’Abbé EN,Steyn M,et al.Estimating the postmortem interval(PMI) using accumulated degree-days (ADD) in a temperate region of South Africa[J].Forensic Sci Int,2013,229(1-3):165.

[7] Simmons T,Adlam RE,Moffatt C.Debugging decomposition data-comparative taphonomic studies and the influence of insects and carcass size on decomposition rate[J].J Forensic Sci,2010,55(1):8-13.

[8] Vass AA.The elusive universal post-mortem interval formula[J].Forensic Sci Int,2011,204(1-3):34.

[9] Liu Q,Cai X,Liu Y,et al.Spectrophotometric determination of trimethylamine-nitrogen in cadaver tissues for the estimation of late postmortem interval: a pilot study[J].J Huazhong U Sci-Med,2008,28(6):630-633.

[10]黃平,托婭,王振原.傅里葉變換紅外光譜技術(shù)在死亡時(shí)間推斷中的運(yùn)用[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2010,26(3):198-201.

[11]郭萍,熊平,張靜.人脾組織DNA含量與死亡時(shí)間關(guān)系的顯微拉曼光譜[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志,2011,123(4):2809-2812.

[12]Xiong P,Guo P,Zhang J.Raman micro spectroscopic analysis of relationship between DNA degradation in tissue cells and postmortem interval[J].Spectrosc Spect Anal,2010,30(6):1511-1115.

[13]張艷林,楊業(yè)全,尹曉宏.反相高效液相色譜法檢測(cè)生物胺的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用初探[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志,2013,28(2):89-91.

[14]劉蓓蓓,夏志遠(yuǎn),馬錦琦,等.大鼠肌肉揮發(fā)性有機(jī)化合物變化規(guī)律與死亡時(shí)間的關(guān)系[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2017,33(2):120-124.

[15]楊天潼,于永光,白敬,等.家兔死后心血氧化還原電位值變化與死亡時(shí)間的關(guān)系[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2013(5):321-324.

[16]Xia Z,Zhai X,Liu B,et al.Conductometric titration to determine total volatile basic nitrogen (TVB-N) for post-mortem interval (PMI)[J].J Forensic Leg Med,2016,44:133-137.

[17]Xia Z,Zhai X,Liu B,et al.Determination of electrical conductivity of cadaver skeletal muscle:a promising method for the estimation of late postmortem interval[J].J Forensic Sci Med,2015,1(1):16-20.

[18]夏志遠(yuǎn),翟仙敦,劉蓓蓓,等.大鼠死后肌肉電導(dǎo)率與腐敗程度的關(guān)系[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2017,33(1):17-20.

[19]夏志遠(yuǎn),翟仙敦,劉蓓蓓,等.肌肉電導(dǎo)率和pH兩指標(biāo)聯(lián)用推斷死亡時(shí)間[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志,2016,31(z1):8-9.

[20]Musshoff F,Klotzbach H,Block W,et al.Comparison of post-mortem metabolic changes in sheep brain tissue in isolated heads and whole animals using 1H-MR spectroscopy-preliminary results[J].Int J Legal Med,2011,125(5):741-744.

[21]Brooks JW.Postmortem changes in animal carcasses and estimation of the postmortem interval[J].Vet Pathol,2016,53(5):929-940.

[22]Mao S,Dong X,Fu F,et al.Estimation of postmortem interval using an electric impedance spectroscopy technique:a preliminary study[J].Sci Justice,2011,51(3):135-138.