汪彩珠 馮貴雪

輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)助孕成功的關(guān)鍵是獲得有活力的胚胎。而胚胎的發(fā)育受卵子和精子質(zhì)量的影響。在早期胚胎的前2次分裂主要受母源基因調(diào)控，而當(dāng)胚胎發(fā)育到4～8細(xì)胞后，胚胎基因組激活，父源基因組開始發(fā)揮作用，異常的精子可能降低后期胚胎發(fā)育潛能，從而影響臨床結(jié)局[1-2]。因此理論上，提高用于授精的精子質(zhì)量能提高ART助孕結(jié)局。

體外受精(in vitro fertilization,IVF)中的常規(guī)精子優(yōu)選方法僅限于精液洗滌中的密度梯度離心法和上游法。卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)中常規(guī)的精子優(yōu)選方法是基于精子活力和200倍或400倍鏡下精子大致形態(tài)進(jìn)行的選擇。然而，這些方法不能有效篩選出DNA完整的精子，事實(shí)上，形態(tài)正常的精子中DNA碎片仍然較高[3]。因此，從提高ART有效性和安全性角度出發(fā)，迫切需要新的精子優(yōu)選技術(shù)。為此，本文對國內(nèi)外報(bào)道的關(guān)于ICSI精子優(yōu)選的新方法進(jìn)行綜述分析。

一、精子膜表面電荷的選擇

成熟精子膜攜帶負(fù)電荷，基于這種表面電荷差異的精子優(yōu)選方法有微流小室電泳法和電動電位法。Ainsworth等[4]首先提出利用微流小室電泳法能有效地分離出前向的、形態(tài)正常的、DNA損傷小的精子。最近，Luke等[5]改進(jìn)了微流電泳法，有效地分離出攜帶負(fù)電荷的健康精子，并認(rèn)為攜帶負(fù)電荷可作為健康精子的潛在生化標(biāo)記。精子電動電位是精子膜和它周圍的電位差，獲能的精子電動電位更低。基于此，Chan等[6]利用電動電位法快速篩選出了形態(tài)正常、DNA完整、成熟的精子。Zahedi等[7]利用該方法也成功優(yōu)選出高比例的形態(tài)正常、DNA碎片低和魚精蛋白缺乏的精子。相比于微流小室電泳法，電動電位法操作更簡單，且不需要昂貴儀器，但是該方法精子回收率低，且不適用于從睪丸或附睪中獲取的精子。因此，依據(jù)精子膜表面電荷的上述兩種精子優(yōu)選方法，缺乏后續(xù)用于IVF或ICSI的妊娠結(jié)局的報(bào)道，也因各自的缺陷，目前尚未能在臨床上廣泛推廣應(yīng)用。

二、非凋亡精子的選擇

凋亡的精子DNA發(fā)生斷裂，影響胚胎的發(fā)育。因此，選擇非凋亡的精子理論上能提高臨床結(jié)局。ART中非凋亡精子的選擇是基于在凋亡早期階段，精子膜磷酯酰絲氨酸外顯化的特征進(jìn)行。常用的有磁性活化細(xì)胞分選法(magnetic-activated cell sorting,MACS)。這種方法是利用磷酯酰絲氨酸與膜聯(lián)蛋白V具有高度親和力的特征進(jìn)行凋亡與非凋亡精子的選擇。研究表明，利用膜聯(lián)蛋白V磁珠與凋亡精子結(jié)合的特性可以有效地從凍融精液中富集非凋亡精子[8]、形態(tài)正常的精子[9]，并且進(jìn)一步研究表明分離柱和磁珠對于精子功能沒有影響[8]。但也有研究表明MACS法富集的精子與上游法富集的精子質(zhì)量類似[10]。Rawe等[11]利用MACS法對高凋亡比率的精液進(jìn)行優(yōu)選，然后進(jìn)行ICSI，獲得了良好妊娠結(jié)局。同樣，Herrero等[12]報(bào)道了一例2次ICSI治療失敗的男性癌癥患者，利用MACS法優(yōu)選復(fù)蘇的精液進(jìn)行ICSI，最終雙胎妊娠。這表明MACS法是一種能提高精液質(zhì)量的有潛力的篩選方法。但是該方法需要與密度梯度離心法結(jié)合使用，精子回收率低，不適用于嚴(yán)重少弱精子，并且部分精子可能攜帶磁珠，存在未知的安全隱患，阻礙了該方法的臨床推廣應(yīng)用。

三、透明質(zhì)酸結(jié)合法選擇

透明質(zhì)酸(hyaluronic-acid,HA)是卵冠丘胞外基質(zhì)的主要成分。精子質(zhì)膜上透明質(zhì)酸結(jié)合位點(diǎn)的形成是精子成熟的標(biāo)志。在正常受精過程中，成熟的精子依靠頭部HA結(jié)合位點(diǎn)與HA結(jié)合并消化HA，從而更好地穿過卵冠丘復(fù)合物與卵子結(jié)合，而不成熟精子則無法與HA結(jié)合。在體外，HA已作為成熟精子的生理選擇器。目前，可直接應(yīng)用的HA精子選擇體系有2種。一種是商業(yè)化的生理性卵胞漿內(nèi)單精子注射皿(physiological intracytoplasmic sperm injection,PICSI)即底部涂有HA的ICSI皿。另一種是含有HA的培養(yǎng)液(spermSlow)。兩種均是在ICSI時(shí)，選擇與HA粘附的精子進(jìn)行顯微注射。

關(guān)于HA優(yōu)選精子的報(bào)道較多。研究表明經(jīng)透明質(zhì)酸結(jié)合試驗(yàn)優(yōu)選出的精子，凋亡標(biāo)記蛋白的比例顯著減少[13],DNA碎片和核異常比例顯著減少[14]，染色體非單倍體的比率也顯著降低[15]。但也有研究表明利用HA優(yōu)選出的精子DNA完整性與常規(guī)PVP中選擇的精子沒有區(qū)別[16]。而臨床研究則表明PICSI相比于常規(guī)ICSI，受精率、胚胎質(zhì)量、種植率、妊娠率和活產(chǎn)率都得到顯著提高，并且受精率與HA結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果密切相關(guān)[17]。但也有研究表明PICSI能提高受精率，對于妊娠率和種植率沒有影響[14]。HA結(jié)合法雖然能優(yōu)選出成熟的精子，但也存在可能將HA帶入卵母細(xì)胞中的不安全隱患。另外，最近一篇Meta分析表明目前尚沒有足夠證據(jù)支持在所有ICSI周期中應(yīng)用HA法進(jìn)行精子優(yōu)選[18]。

四、精子雙折射特性選擇

成熟的精子細(xì)胞核由于縱向定位的頂體下的蛋白纖維絲而具有較高的內(nèi)在雙折射特性。使用偏振光顯微鏡可以進(jìn)行精子雙折射特性的觀察，從而進(jìn)行成熟精子的選擇。研究表明精液中具有雙折射特性精子的比率與精液濃度、活率和活力相關(guān)[19]。對無前向運(yùn)動和睪丸穿刺獲取的精液利用雙折射特性對精子進(jìn)行選擇后行ICSI，雖然受精率和卵裂率沒有差異，但顯著提高了臨床妊娠率、種植率和繼續(xù)妊娠率[19]。此外，利用雙折射特性可以篩選出已發(fā)生頂體反應(yīng)和未發(fā)生頂體反應(yīng)的精子，分別用這些精子進(jìn)行ICSI，結(jié)果表明兩組的受精率和胚胎質(zhì)量沒有區(qū)別，但是頂體反應(yīng)組的胚胎種植率顯著高于未反應(yīng)組[20]。最近的一篇研究也表明利用精子頭部的雙折射特性測量的光延遲值與臨床結(jié)局息息相關(guān)，臨床結(jié)局最佳的精子頭光延遲范圍為0.56 nm～0.91 nm[21]。雖然依據(jù)雙折射特性能優(yōu)選出成熟的精子，但有關(guān)其應(yīng)用的報(bào)道相對較少，而對于后代的安全性則未見相關(guān)報(bào)道。

五、超高倍鏡下精子形態(tài)選擇

細(xì)微的精子形態(tài)學(xué)差異(頂體、細(xì)胞核、線粒體、頂體后致密板和頸部)能通過超高倍顯微鏡(6 000×)觀察到，此技術(shù)稱為MSOME(motile sperm organelle morphology examination )。通過此技術(shù)可以篩選出精子核、頂體后致密板、頂體、頸部及尾部都正常的精子。卵胞漿內(nèi)形態(tài)學(xué)選擇單精子注射(intracytoplasmic morphologically selected sperm injection,IMSI)是MSOME方法在ICSI中的改進(jìn)應(yīng)用[22]。

Bartoov等[22]研究表明IMSI比常規(guī)ICSI能產(chǎn)生更高的妊娠率和抱孩率，但受精率、卵裂率則沒有明顯區(qū)別。隨后，Berkovitz等[23]通過大樣本研究進(jìn)一步證實(shí)了IMSI能顯著提高臨床結(jié)局。一項(xiàng)前瞻性隨機(jī)自身對照研究也表明[24]，對于精液質(zhì)量差、胚胎質(zhì)量差、多次ICSI失敗的患者，IMSI技術(shù)能提高胚胎質(zhì)量和臨床結(jié)局。尤其對于反復(fù)ICSI失敗的患者，IMSI技術(shù)能顯著提高臨床妊娠率和活產(chǎn)率[25-26]。進(jìn)一步研究表明IMSI技術(shù)提高臨床結(jié)局的同時(shí)并沒有影響到胚胎的整倍性[27]。但是，另一項(xiàng)隨機(jī)對照研究則表明IMSI和ICSI技術(shù)對于患者臨床妊娠率和活產(chǎn)率無顯著區(qū)別[28]。另外，由于IMSI技術(shù)操作時(shí)間長且精子長時(shí)間處在PVP中，可能會損傷精子。因?yàn)镻VP能引起精子膜的損傷和誘導(dǎo)頂體反應(yīng)[29]。此外，高倍鏡下光源對配子的潛在影響尚未可知，也存在一定的安全隱患。因此，Meta分析關(guān)于IMSI的隨機(jī)對照研究結(jié)果表明目前尚沒有證據(jù)支持臨床應(yīng)用IMSI[30]。

綜上所述，目前報(bào)道的這些精子優(yōu)選方法在一定程度上能提高精子質(zhì)量，但是這些優(yōu)選方法目前仍然缺乏大量的前瞻性的隨機(jī)對照研究，缺乏可應(yīng)用于所有ICSI患者的證據(jù)支持。另外，這些方法操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、昂貴及潛在的安全隱患阻礙了其進(jìn)一步的推廣應(yīng)用。因此，建立安全、方便、快捷的精子優(yōu)選方法依然是生殖學(xué)家們研究的熱點(diǎn)。

1 Tesarik J.Paternal effects on cell division in the human preimplantation embryo.Reprod Biomed Online,2005,10:370-375.

2 Garcia-Ferreyra J,Luna D,Villegas L,et al.High aneuploidy rates observed in embryos derived from donated oocytes are related to male aging and high percentages of sperm DNA fragmentation.Clin Med Insights Reprod Health,2015,9:21-27.

3 Avendano C,Oehninger S.DNA fragmentation in morphologically normal spermatozoa:how much should we be concerned in the ICSI era? J Androl,2011,32:356-363.

4 Ainsworth C,Nixon B,Aitken R.Development of a novel electrophoretic system for the isolation of human spermatozoa.Hum Reprod,2005,20:226-270.

5 Luke S,Kristin M,Kenneth I,et al.Optimization of microelectrophoresis to select highly negatively charged sperm.J Assist Reprod Genet,2016,33:679-688.

6 Chan PJ,Jacobson JD,Corselli JU,et al.A simple zeta method for sperm selection based on membrane charge.Fertil Steril,2006,85:481-486.

7 Zahedi A,Tavalaee M,Deemeh MR,et al.Zeta potential VS apoptotic marker:which is more suitable for ICSI sperm selection? J Assist Reprod Genet,2013,30:1181-1186.

8 Paasch U,Grunewald S,Wuendrich K,et al.Immunomagnetic removal of cryo-damaged human spermatozoa.Asian J Androl,2005,7:61-69.

9 Hoogendijk CF,Kruger TF,Bouic PJ,et al.A novel approach for the selection of human sperm using annexin V-bingding and flow cytometry.Fertil Steril,2009,91:1285-1292.

10 Curti G,Skowronek F,Vernochi R,et al.Morphological evaluation of sperm from infertile men selected by magnetic activated cell sorting(MACS).Reprod Biol,2014,14:289-292.

11 Rawe VY,Boudri HU,Alvarez Sedó C,et al.Healthy baby born after reduction of sperm DNA fragmentation using cell sorting before ICSI.Reprod Biomed Online,2010,20:320-323.

12 Herrero MB,Delbes G,Chunq JT,et al.Case report:the use of annexin V coupled with magnetic activated cell sorting in cryopreserved spermatozoa from a male cancer survivor:healthy twin newborns after two previous ICSI failure.J Assist Reprod Genet,2013,30:1415-1419.

13 Sakkas D.Novel technologies for selecting the best sperm for in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection.Fertil Steril,2013,99:1023-1029.

14 Parmegiai L,Coqniqni GE,Bernardi S,et al.Physiologic ICSI:hyaluronic acid(HA)favors selection of spermatozoa without DNA fragmentation and with normal nucleus,resulting in improvement of embryo quality.Fertil Steril,2010,93:598-604.

15 Huszar G,Jakab A,Sakkas D,et al.Fertility testing and ICSI sperm selection by hyaluronic acid binding:clinical and genetic aspect.Reprod Biomed Online,2007,14:650-663.

16 Huang MT,Kuo-Kuang L R,Lu CH,et al.The efficiency of conventional microscopic selection is comparable to the hyaluronic acid binding method in selecting spermatozoa for male infertility patients.Taiwan J Obstet Gynecol,2015,54:48-53.

17 Mokánszki A,Tóthné EV,Bodnár B,et al.Is sperm hyaluronic acid binding ability predictive for clinical success of intracytoplasmic sperm injection:PICSI vs.ICSI? Syst Biol Reprod Med,2014,60:348-354.

18 Beck-Fruchter R,Shalev E,Weiss A.Clinical benefit using sperm hyaluronic acid binding technique in ICSI cycles:a systematic review and meta-analysis.Reprod Biomed Online,2016,32:286-298.

19 Gianaroli L,Magli C,Cooldel G,et al.Sperm head’s birefringence:a new criterion for sperm selection.Fertil Steril,2008,90:104-112.

20 Gianaroli L,Magli MC,Ferraretti AP,et al.Birefringence characteristics in sperm heads allow for the selection of reacted spermatozoa for intracytoplasmic sperm injection.Fertil Steril,2010,93:807-813.

21 Vermev BG,Chapman MG,Cooke S,et al.The relationship between sperm head retardance using polarized light microscopy and clinical outcome.Reprod Biomed Online,2015,30:67-73.

22 Bartoov B,Berkovitz A,Eltes F,et al.Pregnancy rates are higher with intracytoplasmic morphologically selected sperm injection than with conventional intracytoplasmic injection.Fertil Steril,2003,80:1413-1419.

23 Berkovita A,EItes F,Lederman H,et al.How to improve IVF-ICSI outcome by sperm selection.Reprod Biomed Online,2006,12:634-638.

24 Knez K,Zorn B,Tomazevic T,et al.The IMSI procedure improves poor embryo developet in the same infertile couples with poor semen quality:A comparative prospective randomized study.Reprod Biol Endocrinol,2011,9:123.

25 Shalom-Paz E,Anabusi S,Michaeli M,et al.Can intracytoplasmatic morphologically selected sperm injection (IMSI)technique improve outcome in patients with repeated IVF-ICSI failure? A comparative study.Gynecol Endocrinol,2015,31:247-251.

26 Setti AS,Braga DP,Figueira RC,et al.Intracytoplasmic morphologically selected sperm injection results in improved clinical outcomes in couples with previous ICSI failures or male factor infertility:a meta-analysis.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2014,183:96-103.

27 Luna D,Hilario R,Dueas-Chacón J,et al.The IMSI procedure improves laboratory and clinical outcomes without compromising the aneuploidy rate when compared to the classical ICSI procedure.Clin Med Insights Reprod Health,2015,12:29-37.

28 La Sala GB,Nicoli A,Fornaciari E,et al.Intracytoplasmic morphologically selected sperm injection versus conventional intracytoplasmic sperm injection:a randomized controlled trial.Reprod Biol Endocrinol,2015,13:97.

29 Kato Y,Nagao Y.Effect of polyvinylpyrrolidone on sperm function and early embryonic development following intracytoplasmic sperm injection in human assisted reproduction.Reprod Med Biol,2012,11:165-176.

30 Teixeira DM,Barbosa MA,Ferriani RA,et al.Regular (ICSI) versus ultra-high magnification (IMSI) sperm selection for assisted reproduction.Cochrane Database Syst Rev,2013,25:CD010167.