冀德君，張威，樊永亮，魏定國，黃必忠

（1.揚(yáng)州大學(xué)動科學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇揚(yáng)州市威威鹿場, 江蘇 揚(yáng)州 225000；3.邗江區(qū)科技局, 江蘇 揚(yáng)州225000)

梅花鹿（Cervus nippon）是一種具很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的食草動物[1]，其鹿茸的藥用價(jià)值首屈一指[2,3]。我國東北地區(qū)有圈養(yǎng)梅花鹿的傳統(tǒng)[4]。我國的人工養(yǎng)殖梅花鹿屬東北亞種[5]，茸產(chǎn)量中等[6]。北方養(yǎng)殖的梅花鹿遷移到南方地區(qū)養(yǎng)殖，適應(yīng)性下降，生產(chǎn)性能也下降，并且容易出現(xiàn)猝死的問題[1]。不過，梅花鹿始終具有在我國所有氣候條件下生存的潛能，可能由于長期的馴化過程，僅能適應(yīng)北方氣候環(huán)境條件。我國歷史上在中、東部地區(qū)的長期農(nóng)業(yè)開發(fā)，使得梅花鹿的棲息地受到破壞，導(dǎo)致我國野生梅花鹿瀕臨滅絕，局限分布于東北大興安嶺等地區(qū)[5]。揭示梅花鹿及其近緣物種的遺傳特性及對特定區(qū)域、氣候的適應(yīng)性狀況將為茸鹿的廣泛推廣提供寶貴的基礎(chǔ)依據(jù)。

早在20 世紀(jì) 70 年代，我國開展了鹿種間和亞種間雜交生產(chǎn)研究[7-10]，花-馬雜交可能會大大提高鹿的生產(chǎn)性能。雜交茸鹿適應(yīng)性強(qiáng)、抗病力強(qiáng)、耐粗飼、生長快。不過雜交實(shí)踐中仍會出現(xiàn)失敗的情況。為揭示花馬雜交遺傳學(xué)的特性變化，本研究依托位于揚(yáng)州地區(qū)某鹿場，采用東北雙陽梅花鹿和新疆天山馬鹿雜交，采用簡化基因組測序的方法，同時(shí)利用生物信息學(xué)工具，分析了具優(yōu)良適應(yīng)性特點(diǎn)的花-馬雜交后代群體的遺傳多樣性，為花馬雜交的推廣提供有用的信息[11,12]。

1 材料與方法

1.1 動物群體

試驗(yàn)動物選自我國東部江淮地區(qū)一個(gè)花馬雜交鹿養(yǎng)殖場（揚(yáng)州市威威鹿業(yè)有限公司）。將健康成年種公馬鹿與母鹿（梅花鹿或花馬雜交鹿）混養(yǎng)。按1∶10的比例配置種公鹿和母鹿，混群飼養(yǎng)，45d左右觀測母鹿的受孕情況。幼鹿斷奶后另組群，跟蹤測定其生產(chǎn)和適應(yīng)性能。

1.2 簡化基因組測序分析

1.2.1 樣本

采用無菌方法分別自5個(gè)雜交公鹿的鹿茸上取1～2g帶血鹿茸組織樣，冷凍保存，提取總DNA并進(jìn)行簡化基因組測序。

1.2.2 步驟

將樣本DNA采用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，RAD建庫，即構(gòu)建300～500bp插入片段的文庫；Illumina HiSeq2000測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

將樣品RAD-tag比對歸類，按每類tag的深度信息進(jìn)行由大到小排序，獲得樣本的RAD-tag頻數(shù)。 接著對樣品RAD-tag兩兩比對，獲得樣品的雜合位點(diǎn)信息。 進(jìn)一步分析樣品間的RAD-tag差異信息。 通過綜合每個(gè)個(gè)體RAD-tag的頻數(shù)和比對差異信息，濾掉重復(fù)區(qū)域的數(shù)據(jù)，最終得到可信度高的群體SNP分型結(jié)果。

1.3 遺傳多樣性分析與BLAST功能分析

隨機(jī)選取20條含SNP的序列片段，使用DNAStar、DNAsp等軟件對這些片段進(jìn)行多態(tài)性分析，運(yùn)用聚類分析軟件繪制系統(tǒng)發(fā)生樹。通過采用blast方法與多種數(shù)據(jù)庫序列比對，獲得這些序列片段的相關(guān)功能注解信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 花-馬雜交后代的生產(chǎn)與適應(yīng)性能

花-馬雜交后代整體表現(xiàn)較好，成活率高，體格健康，少見疾病的發(fā)生。繁育率較高，總適應(yīng)能力評價(jià)為總體適應(yīng)性良好。

2.2 花-馬雜交后代的遺傳多樣性

2.2.1 簡化基因組分析的總體評估

將每個(gè)個(gè)體之間的RAD-tag（80bp）進(jìn)行內(nèi)部比對和兩兩之間的比對，整合深度信息和比對結(jié)果信息，從而得到高可信度的群體SNP分型結(jié)果，最后總共得到489,288個(gè)群體SNP標(biāo)記。

2.2.2 基因座位的遺傳多樣性分析

整合深度信息和比對結(jié)果信息，得到高可信度的群體SNP分型結(jié)果，最后總共得到489,288個(gè)群體SNP標(biāo)記，說明該群體的種群內(nèi)的遺傳多樣性非常豐富。對所有SNP位點(diǎn)進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)變異最高的3個(gè)基因片段(80 bp)，均包含有2個(gè)或3個(gè)SNP位點(diǎn)，定義了5個(gè)等位基因 （圖1）。

用MEGA軟件確定變異位點(diǎn)，以及運(yùn)用MEGA軟件計(jì)算各群間的遺傳距離，并進(jìn)行構(gòu)建進(jìn)化樹。

基于遺傳距離進(jìn)行親緣關(guān)系聚類分析表明，5頭公鹿分為2個(gè)類群，表明其具有至少2個(gè)血統(tǒng)來源（圖2）；

運(yùn)用BLSAT軟件進(jìn)行功能性分析，發(fā)現(xiàn)這些多態(tài)性較豐富的序列區(qū)段相對集中分布于染色體上有關(guān)適應(yīng)功能的分布區(qū)域。

花馬雜交鹿在基因水平上存在的海量SNP位點(diǎn)數(shù)以及較多的高變區(qū)段，說明江淮地區(qū)的花馬雜交后代群體具備培育不同特性品系的遺傳潛能，為進(jìn)一步的品系培育提供遺傳上的素材；同時(shí)，編碼區(qū)上的高多態(tài)性初步提供了鹿產(chǎn)品可能存在特殊活性成分的分子生物學(xué)證據(jù)。

圖1 含四個(gè)基因型的80bp序列區(qū)段

圖2 5頭雜交鹿的系統(tǒng)發(fā)生樹

3 討論

3.1 雜交后代有優(yōu)勢

雜交優(yōu)勢可大幅度提高動物生產(chǎn)效益，在家畜中被普遍認(rèn)可。雜交茸鹿具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗病力強(qiáng)、耐粗飼、生長快的特點(diǎn)，我國自70年代初即開始推廣生產(chǎn)應(yīng)用。

在鹿茸生產(chǎn)上，東北梅花鹿的茸型好、質(zhì)優(yōu)，具有品質(zhì)和價(jià)格優(yōu)勢,可惜茸產(chǎn)量不高,遷移南方地區(qū)養(yǎng)殖往往易發(fā)病,適應(yīng)力不夠,且生長速度慢。而新疆的天山馬鹿具有較高的鹿茸產(chǎn)量,適應(yīng)力好，生長速度快,不過其鹿茸價(jià)格低?？梢钥紤]利用雜交的方法，將二者優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合,也可能會較快地提高梅花鹿的鹿茸生產(chǎn)水平。

3.2 茸鹿群體的遺傳多樣性

梅花鹿與馬鹿親緣關(guān)系較近, 兩者雖然是不同的物種，但在自然條件下兩者可雜交，并且可繁殖后代。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，馬鹿是梅花鹿由中東向歐洲和北非擴(kuò)展過程中產(chǎn)生的。原始型的馬鹿在新世中期從歐洲北上然后返轉(zhuǎn),通過絲綢之路的天山北路返回中國。天山馬鹿的遺傳特性對鹿的選育是不可或缺的。另一方面, 梅花鹿可分為2類：亞洲大陸類群，從越南梅花鹿到臺灣梅花鹿, 最后是東北梅花鹿,和日本類群，其很可能由東北梅花鹿直接演化為日本梅花鹿, 同時(shí)也向馬鹿過渡。馬鹿類群包括甘肅馬鹿和阿拉善馬鹿，而天山馬鹿可能是亞洲類群向歐洲類群過渡的亞種。眾所周知，遺傳多樣性的喪失會對物種生存可能帶來不利影響。據(jù)推測，保持鹿種內(nèi)遺傳多樣性可以減慢由于物種在適應(yīng)和進(jìn)化中可能導(dǎo)致其滅絕的過程。

3.3 雜交動物的實(shí)踐意義

雖然東北梅花鹿具有茸型好、質(zhì)優(yōu)，具有品質(zhì)和價(jià)格優(yōu)勢,但茸產(chǎn)量偏低，生長慢?？紤]我國茸鹿養(yǎng)殖業(yè)的困難，雖然東北梅花鹿數(shù)量大，但其生產(chǎn)性能很難提高。將天山馬鹿和東北梅花鹿的兩者優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，很可能會大大提高茸鹿生產(chǎn)水平。利用天山馬鹿作為父本來雜交改良梅花鹿，實(shí)踐效果顯著，雜種后代的生產(chǎn)性能，包括產(chǎn)茸性能都有了較大的提高?；R雜交是當(dāng)前提高養(yǎng)鹿效益的重要途徑。

本研究進(jìn)一步展示了鹿科動物具有極豐富的遺傳多樣性。基因組水平的多態(tài)性特征反映了鹿科動物具有很好的適應(yīng)潛能。本研究初步表明花馬雜交具有豐富的遺傳多樣性，可能具有較好的適應(yīng)性潛能。

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