王 冉, 于富強

(中國科學院 昆明植物研究所 資源植物與生物技術(shù)重點實驗室，云南 昆明 650201)

真菌能否順利侵染植物幼根并形成菌根，不僅取決于周圍的非生物因素，如土壤pH值、肥力、濕度和溫度等[1]，也受到一些生物因素，如微生物等[2]的影響。早在1979年，Bowen等[3]研究了不同外生菌根真菌與不同細菌之間的相互作用，實驗表明土壤內(nèi)微生物在真菌菌根形成過程中起著重要的作用。1994年法國學者Garbaye[4]首次提出了菌根促生細菌(Mycorrhiza helper bacteria,MHB) 的概念，MHB是指能夠與菌根真菌特異性結(jié)合，并促進菌根真菌在宿主植物根部的定植和生長，進而間接地促進植物生長的細菌。這些微生物不僅存在于真菌與宿主植物形成的菌根中，還存在于真菌的子實體及其菌塘土壤中，它們直接或間接的影響著真菌菌根的形成、發(fā)育和發(fā)展。國內(nèi)外學者在大型真菌相關(guān)的微生物研究方面開展了許多工作，Poole等[5]從紅乳菇Lactariusrufus與樟子松形成的菌根中分離得到7種不同的細菌類群；Wan等[6]研究了國產(chǎn)白塊菌子囊果內(nèi)微生物的多樣性；姜華等[7]從松茸的菌塘內(nèi)分離到豐富的細菌類群；Kumari等[8]研究了雞油菌的不同子實體內(nèi)微生物，并獲得變形菌門的多種細菌；另外，鵝膏屬(Amanita)、黏滑菇屬(Hebeloma)、蠟蘑屬(Laccaria)和乳牛肝屬(Suillus)等子實體內(nèi)也被報道有多種細菌的存在[9-11]。乳菇屬(Lactarius)隸屬紅菇目(Russulales)、紅菇科(Russulaceae)，全球廣布，能與松科、殼斗科、樺木科等經(jīng)濟樹種形成外生菌根，是森林生態(tài)系統(tǒng)中的重要成員[12-14]。該屬的一些種類在世界各地廣為采食[15-16]，如松乳菇(L.deliciosus)、紅汁乳菇(L.hatsudake)和橙黃乳菇(L.akahatsu)等，在云南乳菇因子實體含有豐富的乳汁，而被當?shù)厝朔Q為奶漿菌。國內(nèi)外開展了大量的乳菇菌根合成與人工栽培研究[17-18]，然而針對相關(guān)微生物的研究鮮見報道，鑒于微生物在菌根形成、發(fā)育、發(fā)展過程中的重要作用，本研究從乳菇子實體內(nèi)分離，并對其多樣性展開分析，為進一步研究細菌與乳菇的相互作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2015年6月29日于云南省昆明市茨壩農(nóng)貿(mào)市場購買松乳菇(HKAS90710)和紅汁乳菇(HKAS90711)樣品，憑證標本存放于中國科學院昆明植物研究所隱花植物標本館(HKAS)。

1.2 方法

1.2.1 分離與培養(yǎng) 在兩種乳菇中分別挑選新鮮、無蟲咬的4個子實體(松乳菇：L1a-L1d；紅汁乳菇：L2a-L2d)，取菌蓋與菌柄交界處菌肉0.5 g，放入滅菌的5 mL EP管內(nèi)，加入0.85% NaCl 4.5 mL，用組織研磨儀充分打碎。將研磨后的菌肉組織置于28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)30 min。取10-1g/mL菌液，將其稀釋為10-2～10-6g/mL。選擇10-2、10-3、10-4g/mL菌液進行涂布。不同濃度菌液各取100 μL在TSA培養(yǎng)基中(每種濃度各3個重復)用滅菌涂布棒進行均勻涂布，待菌液干后，將平板倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。選擇菌落數(shù)在30～300的平板，對其進行菌落計數(shù)。同時用滅菌的牙簽挑取單菌落在1.5 mL TSB液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.2 NA提取與擴增 對TSB液體培養(yǎng)基中的細菌，5 000×g下離心10 min，棄上清液，加入TES buffer(20 mmol/L Tris, 50 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaCl，pH 7.9)，13 000×g下離心2 min；再加入1.2 mL TES buffer重懸；加入300 μL溶菌酶(5 mg/mL)裂解細胞，并將其置于37 ℃下60 min。16S rDNA擴增，擴增引物(上海生工)63f：5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′，1495r：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA -3′；25 μL PCR體系(寶生物工程)中包含1 μL DNA、1 μL引物(5 μmol/L)、2 μL 10× buffer (Mg2+free)、1 μL dNTP(10 μmmol/L)、0.5 μL BSA(1%)、1.5 μL MgCl2、0.3 UTaq酶；PCR條件為95 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，72 ℃10 min，共27個循環(huán)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 使用BLAST對獲得的序列與GenBank中的序列進行比對，相似度大于98%的作為一個OTU。使用ContigExpress拼接與編輯序列，在BioEdit v7.0.9中進行比對和自動排序，排好的序列用Mega 6.0中的Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌數(shù)量多樣性

從4個松乳菇子實體內(nèi)分離得到細菌66株10種6屬，隸屬于變型菌門的β-變形菌綱、γ-變型菌綱和擬桿菌門；4個紅汁乳菇子實體內(nèi)分離得到細菌48株7種7屬，隸屬于變型菌門的γ-變型菌綱、厚壁菌門和擬桿菌門。對不同子實體內(nèi)分離得到的細菌CFU進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示(表1、表2)，松乳菇子實體內(nèi)細菌數(shù)量為(3.9～5.0)×104cfu/g，對應的4個子實體內(nèi)都有γ-變型菌門的細菌，子實體a和d中還分離得到擬桿菌門的細菌，此外除子實體b，其余子實體內(nèi)都分離得到β-變型菌門的細菌；紅汁乳菇子實體內(nèi)細菌數(shù)量為(0.66～1.2)×104cfu/g，對應的4個子實體內(nèi)都有γ變型菌門的細菌，子實體c中還分離得到厚壁菌門的細菌，而子實體b中則分離得到擬桿菌門的細菌。兩種乳菇中γ-變形菌門細菌均為優(yōu)勢類群。

表1 松乳菇4個子實體內(nèi)細菌計數(shù)

表2 紅汁乳菇4個子實體內(nèi)細菌計數(shù)

2.2 細菌種類多樣性

2.2.1 松乳菇子實體內(nèi)細菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹及多樣性分析 從以Pyrococcusfuriosus為外類群構(gòu)建的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹上(圖1)可以看出，松乳菇子實體內(nèi)細菌分別很好的聚在了3大支內(nèi)，包括變型菌門的β-變形菌綱、γ-變型菌綱和擬桿菌門。γ-變型菌綱為各子實體內(nèi)的主要細菌類群，包括假單胞菌屬Psedomonas、愛文氏菌屬Ewingella、西地西屬菌屬Cedecea和Lelliottia，其中假單胞菌屬為優(yōu)勢屬，占細菌總數(shù)的51.1%，熒光假單胞菌Psedomonasfluorescens為該屬中的主要種類(占該屬細菌總數(shù)的47.1%)；愛文氏菌屬、西地西屬菌屬和Lelliottia分別占細菌總數(shù)的13.64%、4.54%和7.57%。此外，松乳菇子實體內(nèi)細菌還包括β-變形菌綱的Pandoraea(12.12%)和擬桿菌門的金黃桿菌屬Chryseobacterium(10.6%)。

2.2.2 紅汁乳菇子實體內(nèi)細菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹及多樣性分析 從以Pyrococcusfuriosus為外類群構(gòu)建的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹上可以看出(圖2)，紅汁乳菇子實體內(nèi)細菌分別很好的聚在了3大支內(nèi)，包括變型菌門的γ-變型菌綱、厚壁菌門和擬桿菌門。4個子實體內(nèi)的細菌多樣性都表現(xiàn)為γ-變型菌綱為主要細菌類群，在紅汁乳菇子實體中，γ-變型菌綱包括了5個屬的細菌，其中愛文氏菌屬為優(yōu)勢菌屬，占細菌總數(shù)的33.33%，但此屬僅包括美洲愛文氏菌Ewingellaamericana一個種。另外γ-變型菌綱中還包括了假單胞菌屬(16.67%)、Yersinia(8.33%)、泛菌屬Pantoea(12.5%)和西地西屬菌屬(6.25%)。除了變型菌門，紅汁乳菇子實體內(nèi)細菌還包括厚壁菌門的芽胞桿菌屬Bacillus(14.58%)及擬桿菌門的金黃桿菌屬(8.33%)。

圖1 基于松乳菇子實體內(nèi)部分細菌16S rDNA構(gòu)建的Neighbor-Joining進化樹Fig.1 Neighbor-joining tree based on 16S rDNA gene partial sequences isolated from sporocarps of L. deliciosus每個支點迭代運算1 000次，序列Pyrococcus furiosus NR113294.1選作外類群，下圖同The number at each branch node are bootstrap numbers from 1 000 re-samplings，the sequence of Pyrococcus furiosus NR113294.1 has been included as out group,same the follow

圖2 基于紅汁乳菇子實體內(nèi)部分細菌16S rDNA構(gòu)建的Neighbor-Joining進化樹Fig.2 Neighbor-joining tree based on 16S rDNA gene partial sequences isolated from sporocarps of L. hatsudake

3 討 論

子實體內(nèi)特殊的微環(huán)境和營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，為特定細菌的生存繁衍提供了條件，特別是一些腐生或寄生型細菌。有研究表明，子實體內(nèi)特定細菌的單位數(shù)量較周圍土壤中的單位數(shù)量還要多，這些細菌可能是導致食用菌腐爛等病變的重要原因，在食用菌生活史中具有重要意義[19]。

本研究從松乳菇和紅汁乳菇子實體中分離獲得細菌，并對獲得的細菌進行數(shù)量和種類多樣性分析。從數(shù)量多樣性可以看出，松乳菇子實體內(nèi)細菌平均數(shù)量大于紅汁乳菇子實體內(nèi)細菌數(shù)量。兩種乳菇分離到的細菌優(yōu)勢菌群都屬于變型菌門的γ-變型菌綱，松乳菇中假單胞菌屬為優(yōu)勢菌屬，熒光假單胞菌為優(yōu)勢菌。前人的研究表明假單胞菌屬Pseudomonas、芽胞桿菌屬、類芽胞桿菌屬Paenibacillus等都是外生菌根真菌中普遍存在的細菌類群[5，20-21]。Poole等[5]分離了紅乳菇與樟子松形成的菌根中的微生物，其中優(yōu)勢菌包括伯克氏菌屬Burkholderia和假單胞菌屬的細菌；Wan等[6]從國產(chǎn)白塊菌子實體內(nèi)分離到的細菌中，優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬。作為優(yōu)勢菌種的熒光假單胞菌還是一種重要的植物病害生防菌和根際促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)，同時它對外生菌根真菌的生長也有一定作用。李守萍等[22]探討了熒光假單胞菌與菌根真菌的互作關(guān)系，發(fā)現(xiàn)一定濃度的熒光假單胞菌菌液能夠促進外生菌根真菌的生長，Sbrana等[23]研究表明被波氏塊菌Tuberborchii侵染的歐洲櫟Quercusrobur菌根上的細菌多為熒光假單胞菌Pseudomonasfluorescens和皺紋假單胞菌P.corrugata，此類細菌具有促進菌根真菌孢子萌發(fā)和菌絲體生長的作用。松乳菇中次生優(yōu)勢菌屬包括愛文氏菌屬、β-變形菌綱的Pandoraea、擬桿菌門的金黃桿菌屬，這些細菌類群從其他真菌中也分離獲得過。除了以上類群，從松乳菇子實體中還分離得到少量Lelliottia，此細菌在之前的研究中未被報道。

紅汁乳菇中優(yōu)勢菌屬為愛文氏菌屬，此屬在1983年由Grimont等提議為新屬，美洲愛文氏菌為模式種Inglis等[24]從雙孢蘑菇中獲得美洲愛文氏菌，實驗結(jié)果表明美洲愛文氏菌常出現(xiàn)于有病癥的蘑菇中。但本研究挑選的實驗材料都是健康、新鮮、無蟲的。Kumani等[8]分離了不同采集地的雞油菌子實體內(nèi)細菌，從中也獲得了美洲愛文氏菌，此菌株可能是專性生活在子實體內(nèi)部的腐生型細菌。紅汁乳菇中次優(yōu)勢菌屬包括假單胞菌屬、厚壁菌門的芽胞桿菌屬、擬桿菌門的泛菌屬。芽胞桿菌屬主要包括的細菌為解淀粉芽胞桿菌，此細菌在自身的生長過程中可以產(chǎn)生一系列的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物使解淀粉芽胞桿菌能夠廣泛抑制真菌和細菌的活性，可以適當代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學農(nóng)藥[25]。

本研究是從乳菇子實體內(nèi)分離獲得細菌。除了子實體，菌根真菌的菌根、根際土壤中都有著豐富的微生物群落。今后的實驗將從以上方面獲得細菌，并對不同來源的細菌進行差異性的比較。1994年Garbaye[4]首次提出菌根促生細菌(MHB)的概念，細菌多樣性的研究將為進一步獲得MHB提供理論基礎。繼續(xù)研究乳菇菌根、根際土壤內(nèi)的微生物多樣性，并通過進一步實驗獲得菌根促生細菌，這是未來實驗的主要方向。

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