聶昊，胡洋，唐洲平

外泌體（exosomes）是由脂質(zhì)雙分子層包裹形成的類圓形膜性小體，是胞外囊泡的一種類型，內(nèi)含多種蛋白質(zhì)、RNA、miRNA、生長因子及其受體等。外泌體在多種細(xì)胞中廣泛存在，其與來源細(xì)胞有相同的標(biāo)記物，可據(jù)此鑒定外泌體的來源和性質(zhì)。

1 胞外囊泡的分類

根據(jù)分子大小和釋放方式的不同，胞外囊泡分為外泌體、微囊泡、凋亡小體。外泌體是其中直徑最小者，約為40～100 nm，產(chǎn)生方式為胞吞胞吐，可通過其表面表達的CD81、CD63、Alix等分子進行鑒定。

2 外泌體的作用機制

曾經(jīng)外泌體被認(rèn)為是細(xì)胞排出的碎片等無用物質(zhì)，但近年來，研究發(fā)現(xiàn)外泌體中包含多種重要分子，參與多種生理病理過程，具有廣闊的研究前景。

2.1 參與免疫反應(yīng)

包括樹突狀細(xì)胞等在內(nèi)的免疫細(xì)胞來源的外泌體具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用包括調(diào)控抗原呈遞、介導(dǎo)免疫活化和免疫抑制、免疫監(jiān)視和調(diào)控細(xì)胞間通訊[1-4]。參與免疫調(diào)節(jié)的外泌體內(nèi)小分子包括CD73、乳凝素、FasL、膜上轉(zhuǎn)化生長因子等[5,6]。外泌體上細(xì)胞表面和部分膜、黏附蛋白對于其調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞的識別、黏附、抗原提呈和受體細(xì)胞功能至關(guān)重要。外泌體可被臨近受體細(xì)胞捕捉，作用機制包括細(xì)胞內(nèi)黏附分子1和淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1、磷脂絲胺酸、T細(xì)胞免疫球蛋白域和黏蛋白域蛋白4之間的相互作用等[4,7]。

這些膜結(jié)構(gòu)的微粒是潛在的免疫治療藥物。外泌體來源的抗原肽-MHC復(fù)合物可協(xié)助抗原提呈細(xì)胞向反應(yīng)性T細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[8]。Thery等[9]發(fā)現(xiàn)，DC細(xì)胞來源的外泌體除了可介導(dǎo)體內(nèi)外幼稚T細(xì)胞的分泌，也可協(xié)助MHC-II類分子缺如的DC細(xì)胞激活T細(xì)胞。

2.2 作為運輸載體

外泌體具有天然磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，且攜帶特異的表面標(biāo)志，易被靶細(xì)胞識別并攝取，因此具有內(nèi)在的跨越生物屏障的能力。外泌體為細(xì)胞的自身產(chǎn)物，比外源性藥物的毒性小，可避免被機體免疫系統(tǒng)識別、吞噬，故藥物運轉(zhuǎn)效率高。外泌體表達的多種物質(zhì)均與母細(xì)胞相同，包括脂質(zhì)、各種生長因子和核糖核酸等[10,11]。

2.2.1 外泌體作為腫瘤相關(guān)載體 不同來源及處理方式的外泌體具有抗腫瘤和致腫瘤的作用。體外實驗中，CD105陽性的腎臟來源癌細(xì)胞分泌的外泌體，可激活內(nèi)皮細(xì)胞在基底膜的毛細(xì)血管生發(fā)，增強腫瘤細(xì)胞的抗藥性[12,13]。在小鼠乳腺癌動物模型中，茶素沒食子酸可發(fā)揮抑制腫瘤增長的效果。機理可能與茶素沒食子酸酯可上調(diào)miRNA-16在腫瘤細(xì)胞中的表達，其通過外泌體進入腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，抑制其浸潤和M2型巨噬細(xì)胞的極化有關(guān)[14]。

外泌體可能通過調(diào)節(jié)不同免疫細(xì)胞的種類，形成一個促腫瘤發(fā)生的環(huán)境。在同源免疫交互作用過程中，存在抗原驅(qū)動從T細(xì)胞向APC的單向miRNA轉(zhuǎn)移，這一過程由CD63陽性的外泌體介導(dǎo)。通過靶向作用于神經(jīng)鞘磷脂酶2抑制外泌體及其產(chǎn)物后，減少了miRNA從T細(xì)胞向APC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[15,16]。

人工修飾的外泌體也在臨床研究中起到一定作用。外泌體可有效地傳送miRNA到表達生長因子受體的乳腺癌細(xì)胞中。通過編輯產(chǎn)生外泌體的供體細(xì)胞，使其表達融合了GE11多肽的血小板生長因子受體跨膜域。攜帶有l(wèi)et-7a miRNA核酸藥物的外泌體可通過靜脈注射，靶向到達表達EGFR的異體RAG2(-/-)小鼠乳腺癌組織中，達到治療目的[17]。

2.2.2 外泌體作為炎癥相關(guān)載體 外泌體作為炎癥載體，內(nèi)含多種蛋白、細(xì)胞因子，通過這些內(nèi)含物的釋放，可以發(fā)揮促炎或抑炎的作用。

外泌體可攜帶錯構(gòu)和病原蛋白，造成疾病在臨近細(xì)胞間的傳播。感染型的羊瘙癢病朊蛋白可被外泌體攜帶，外泌體在相鄰細(xì)胞間交換，把朊病毒擴散到機體的多個器官或多個不同機體[18,19]。P2X7受體激活可促使成熟及未成熟DC細(xì)胞膜上外泌體的分泌，鑒于成熟DC細(xì)胞前期受到激活刺激，母細(xì)胞為成熟DC細(xì)胞來源的外泌體內(nèi)含IL-1β、凋亡小體1、凋亡小體3、組織蛋白酶D等炎癥因子和分子，P2X7受體的激活可促進外泌體內(nèi)IL-1β的釋放[20]。

外泌體也可作為攜帶抗炎藥物的工具。如將外泌體作為遞送姜黃素等抗炎介質(zhì)的載體，姜黃素在體內(nèi)更穩(wěn)定，血藥濃度更高，在很大程度上克服脫靶效應(yīng)，提高生物利用率[21]。

3 外泌體的分離和純化

目前外泌體的分離和純化主要有差速離心法和試劑盒法。差速離心法是從體液或上清中分離外泌體的主要方法之一。離心的層次越多，得到外泌體的純度越高。密度梯度離心的方式有助于得到純度更高的外泌體。試劑盒提取外泌體目前廣為應(yīng)用。包括美國System Biosciences的一系列生物公司已推出了成熟的外泌體試劑盒產(chǎn)品。其主要優(yōu)勢是提取過程簡便、快速，大大降低人力成本。但此法提取的外泌體純度相對較低，價格高昂，且混雜不同種類的胞外囊泡，是其研究應(yīng)用中的短板。除此之外，過濾、超濾、凝膠色譜、磁珠免疫親和性捕獲、微流體等方式也可用于提取外泌體[22-25]。

4 外泌體的評價方法

外泌體的鑒定，目前應(yīng)用最多的技術(shù)為流式細(xì)胞術(shù)，但其分辨率較低。電鏡可以觀察外泌體的形態(tài)和大小。電鏡結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，是高質(zhì)量的外泌體鑒定手段[26]。通過外泌體膜上特異性表達的分子標(biāo)記物（CD63、CD81、Alix等），也可對外泌體的性質(zhì)進行相關(guān)探究。此外，共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡等技術(shù)也可用于外泌體的鑒定。

5 外泌體對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的免疫調(diào)節(jié)

5.1 多發(fā)性硬化

多發(fā)性硬化是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性免疫性炎性脫髓鞘疾病，發(fā)病機制與遺傳、自身免疫和環(huán)境等因素有關(guān)[27]。在多發(fā)性硬化的發(fā)病過程中，TNFα、IL-1β、IFN-β等促炎因子釋放；白細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板等炎癥細(xì)胞和各種免疫細(xì)胞增殖、趨化和聚集；血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，血腦屏障通透性增加；細(xì)胞因子和趨化因子的釋放反之加重炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞的聚集活化，共同導(dǎo)致多發(fā)性硬化的慢性疾病狀態(tài)。目前多發(fā)性硬化的診斷多依賴于影像學(xué)磁共振和腦脊液的鑒定[26,28]。

外泌體在多發(fā)性硬化的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。其在體內(nèi)外均可促進免疫炎癥因子的趨化和聚集。多發(fā)性硬化的特效藥物可降低腦脊液中外泌體的數(shù)量，提示外泌體可以作為多發(fā)性硬化的標(biāo)志物之一。炎癥狀態(tài)下，外泌體的表達增加，增強細(xì)胞內(nèi)、外炎癥介質(zhì)（IL-1β、IL-6、COX2、iNOS等）的交換，炎癥因子的釋放，也促進免疫細(xì)胞的趨化，免疫細(xì)胞反過來增加含炎癥因子的外泌體的釋放，從正反兩相促進疾病進程[29]。

5.2 視神經(jīng)脊髓炎

視神經(jīng)脊髓炎是視神經(jīng)與脊髓同時或相繼受累的急性或亞急性脫髓鞘病變。視神經(jīng)脊髓炎與多發(fā)性硬化在疾病初期難以鑒別，水通道蛋白4（aquaporin4，AQP4）抗體被認(rèn)為是區(qū)別兩者的重要病原學(xué)依據(jù)。具有高度特異性的血清自身抗體NMOIgG特異性攻擊星形膠質(zhì)細(xì)胞上的AQP4，AQP4抗體誘導(dǎo)的補體活化是視神經(jīng)脊髓炎的始動因素[30]。通過對NMO患者的腦脊液分離出的外泌體的蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，外泌體內(nèi)含的NMO標(biāo)志性蛋白（例如膠質(zhì)細(xì)胞纖維原酸性蛋白GFAP）的表達有特異性的增加，結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)相一致。與此同時，MS、特發(fā)性縱橫肌炎（I-LETM）的特異性標(biāo)志物也有相應(yīng)表達。提示我們可以將腦脊液外泌體分析作為神經(jīng)系統(tǒng)免疫疾病鑒別診斷的手段之一[31]。

5.3 重癥肌無力

重癥肌無力是由神經(jīng)-肌肉接頭處傳遞功能障礙所引起的自身免疫性疾病[32]。其發(fā)病機理與輔助性T細(xì)胞TH1和TH2細(xì)胞的活化有關(guān)，它們作用于AChR特異性B細(xì)胞，激活體液免疫，產(chǎn)生特異性AChR抗體。有報道指出，抗原特異性不成熟DC來源外泌體可有效減輕實驗性自身免疫性重癥肌無力的肌無力程度及病理性自身抗體水平，其治療效果呈抗原特異性和部分劑量依賴性。其機制與外泌體減輕CD4+T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、調(diào)整Th細(xì)胞由Th17、Th1向Treg極化有關(guān)[33]。免疫性樹突狀細(xì)胞來源的外泌體在免疫性疾病中表現(xiàn)出一定的免疫抑制活性，其通過減少AChR反應(yīng)性淋巴細(xì)胞增殖、降低AChR抗體水平和促炎因子水平，改善實驗性自身免疫性重癥肌無力的進展[34]。

5.4 阿爾茨海默病

外泌體還參與了中樞系統(tǒng)其他疾病的發(fā)生發(fā)展，包括阿爾茨海默病和帕金森病。阿爾茨海默病的發(fā)病、進展與β淀粉樣蛋白與tau蛋白參與的淀粉樣斑塊形成和神經(jīng)功能退行性病變息息相關(guān)，外泌體則參與了β淀粉樣蛋白和tau蛋白在機體內(nèi)的代謝、轉(zhuǎn)運等的過程[34-36]。Vingtdeux等[36]研究顯示，神經(jīng)退行性疾病的病理生理學(xué)機制與蛋白質(zhì)錯構(gòu)的朊病毒增殖有關(guān)，外泌體可能參與阿爾茨海默病中毒性物質(zhì)的寡聚體和多聚體的轉(zhuǎn)運和傳播，阻斷這一病理過程也可能成為治療阿爾茨海默病的潛在方法。

5.5 帕金森病

在帕金森病的病理學(xué)改變是中腦黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元變性、缺失，剩余的多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)形成嗜酸性包涵體（即路易氏小體），該包涵體的主要成分為α-突觸核蛋白。α-突觸核蛋白廣泛存在于多種體液中，在過表達α-突觸核蛋白的SH-SY5Y細(xì)胞分泌的外泌體中發(fā)現(xiàn)了α-突觸核蛋白，這些外泌體可將α-突觸核蛋白傳遞至正常SH-SY5Y細(xì)胞中，在α-突觸核蛋白傳遞過程中發(fā)揮重要作用[37]。另外，小膠質(zhì)細(xì)胞可分泌MHC-II類分子和TNF-α，而α-突觸核蛋白可促進其分泌?；罨耐饷隗w加速細(xì)胞凋亡?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體或參與了α-突觸核蛋白相關(guān)性帕金森病中的發(fā)病過程[38]。

6 小結(jié)

目前關(guān)于神經(jīng)系統(tǒng)免疫疾病與外泌體之間關(guān)聯(lián)的研究仍相對較少，本綜述對外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)免疫疾病中的作用進行總結(jié)，探索神經(jīng)系統(tǒng)免疫疾病發(fā)病機制的新突破口。在臨床研究中，外泌體自身在靶向性、免疫原性和攜帶生物活性分子等方面的巨大優(yōu)勢，使之成為基礎(chǔ)研究和臨床實踐中極具潛力的“新興明星”。