黃薇隗，彭偉，江蓉，徐內(nèi)衛(wèi)，鄧飛

癲癇是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)病率可達0.006%以上[1]。基因多態(tài)性可以通過影響特定基因的轉(zhuǎn)錄或蛋白翻譯，影響相關(guān)靶物質(zhì)的表達，從而影響神經(jīng)電沖動的傳遞。神經(jīng)調(diào)節(jié)因子-1（neural regulatory factor，NRG-1）基因多態(tài)性可通過影響神經(jīng)原鞘膜跳躍式傳遞的方式，影響局部神經(jīng)元的異常放電，促進癲癇的發(fā)生發(fā)展[2-4]。本研究選取我院就診的癲癇患者，探討rs35753505、rs6994992和rs62510682基因型和等位基因位點的基因型分布，為揭示基因多態(tài)性對于癲癇發(fā)生的影響提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年2月至2016年3月我院治療的顳葉癲癇患者124例為病例組，其中男73例，女51例；年齡19～29歲，平均年齡（25.13±7.81）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合1989年ILEA公布的癲癇診斷標(biāo)準(zhǔn)；均為漢族；患者及家屬知情同意并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：有腦部外傷、皮質(zhì)發(fā)育不良、精神發(fā)育遲緩等神經(jīng)精神病變。同時選取漢族健康志愿者124例為對照組，其中男80例，女44例；年齡19～29歲，平均年齡（25.02±8.22）歲，2組性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.836，t=0.108，均P＞0.05）。

1.2 方法

基因多態(tài)性檢測：取凍存的血清保存液體，10000 r/min離心5 min，TRIZOL法提取總RNA。70℃干浴3 min，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，37 ℃水浴60 min，室溫放置5 min使其完全溶解，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以βactin為模版，在反應(yīng)體系中加入SYBR Green 1染料、上游引物、下游引物、dNTP，使得總體積達20 μL。反應(yīng)條件為：93 ℃2 min、93 ℃ 1 min、55℃ 2 min，共40個循環(huán)。

PCR產(chǎn)物擴增后進行基因多態(tài)性檢測：參考multiplexkit試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）使用說明，加入各位點對應(yīng)延伸引物進行單堿基測序反應(yīng)。并在ABI1310（Life Technologies，美國）進行電泳，結(jié)果用GENEMAPPER軟件（Life Technologies，美國）進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 2組Hardy-Weinberg平衡檢驗

本次研究共檢測到NRG1基因的3個單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點，包括rs35753505、rs6994992和rs62510682，2組各位點基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，表明2組受試者的人群代表性較好，見表1。

2.2 NRG1基因多態(tài)性與顳葉癲癇易感性的關(guān)系

SNP rs35753505基因型和等位基因分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中CC基因型者患顳葉癲癇的OR值為3.941（1.806～8.599），等位基因C的OR值為1.977（1.378～2.837）；SNP rs6994992等位基因分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中CT基因型者患顳葉癲癇的OR值為1.018（1.378～2.837），等位基因 T 的OR值為 1.475（1.027～2.118）；SNP rs62510682基因型和等位基因分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

3 討論

表1 2組受試者Hardy-Weinberg平衡檢驗

表2 NRG1基因多態(tài)性與顳葉癲癇易感性的關(guān)系

基因水平的改變可以通過影響轉(zhuǎn)錄或蛋白翻譯等環(huán)節(jié)，影響神經(jīng)元電沖動的傳遞[5,6]。基因多態(tài)性是靶基因的部分位點發(fā)生的基因突變，進而導(dǎo)致基因或基因型的改變，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元鞘膜的跳躍式電傳遞[7-9]。對于相關(guān)基因多態(tài)性的研究，可以為臨床上癲癇的生物學(xué)治療提供新的作用靶點。

NRG1基因是編碼多巴胺末端修飾蛋白的重要基因，其rs35753505、rs6994992和rs62510682位點的多態(tài)性變化，可影響其蛋白活性，多巴胺的末端磷酸化或羥基化修飾的不足，導(dǎo)致多巴胺在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的降解加快，濃度相對不足，通過負反饋促進神經(jīng)元間的信號傳遞或電傳遞，導(dǎo)致患者出現(xiàn)癲癇大發(fā)作或部分性發(fā)作等癥狀[5,10]。研究顯示，NRG1基因可激活海馬神經(jīng)元細胞的興奮性電傳動，加重病情[11,12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，rs35753505、rs6994992和rs62510682這3個研究節(jié)點的人群分別符合Hardy-Weinberg平衡，提示本研究所選擇的樣本具有較為理想的代表性，統(tǒng)計結(jié)果較為可靠。SNP rs35753505基因型和等位基因分布差異，提示SNP rs35753505的分布異常可能參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展，其中等位基因C的比例明顯高于等位基因T，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。等位基因C的比例上升，可通過促進下游轉(zhuǎn)錄蛋白的翻譯，進而促進神經(jīng)元鞘膜組織的新生，并增加神經(jīng)元細胞膜間的電傳導(dǎo)聯(lián)系，促進局部神經(jīng)元的異常同步放電。有研究者通過回顧性收集分析了92例樣本量的臨床資料，發(fā)現(xiàn)等位基因C在NRG1基因的多態(tài)性表達中具有顯著的差異性分布趨勢，其中SNP rs35753505的表達異?？梢栽黾?%左右的癲癇的發(fā)作的出現(xiàn)[13,14]，這與本研究的結(jié)論較為一致。SNP rs6994992等位基因分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且等位基因T的表達也明顯高于等位基因C，考慮到SNP rs6994992等位基因分別的差異，可以通過接觸抑制性神經(jīng)元遞質(zhì)谷氨酰胺或磷酸腺苷等的釋放，進而促進神經(jīng)元軸突末梢間神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，導(dǎo)致神經(jīng)元同步放電的發(fā)生，促進病情的進展。本研究并未發(fā)現(xiàn)SNP rs62510682基因型和等位基因分布異常，考慮可能與樣本量的選擇、癲癇多態(tài)性問題的地區(qū)性差異及檢測試劑盒等不統(tǒng)一有關(guān)。

綜上所述，rs35753505、rs6994992可通過影響等位基因的多態(tài)性表達，可能在促進癲癇的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了一定的作用。但鑒于本次研究的樣本量較小，后續(xù)研究將增加樣本量，采用多中心的臨床研究探討其內(nèi)在關(guān)系。