董孟佳+許尤琪+沈明勤

摘要：目的 觀察健脾活血方對肝癌裸鼠皮下移植瘤模型細(xì)胞凋亡和血管生成的影響，探討其可能的作用機制。方法 建立SMMC-7721肝癌荷瘤裸鼠模型。將60只雄性荷瘤裸鼠隨機分為空白組、模型組、5-Fu組和健脾活血方高、中、低劑量組，每組10只。健脾活血方各劑量組給予相應(yīng)濃度健脾活血方藥液灌胃，每日1次，5-Fu組給予5-Fu隔日腹腔注射，連續(xù)2周。2周后比較各組裸鼠體質(zhì)量、瘤質(zhì)量和抑瘤率，免疫組化檢測血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和VEGF受體2（VEGFR-2）的蛋白表達(dá)，計算微血管密度（MVD），qRT-PCR檢測Caspase-3和生存素（Survivin）的mRNA表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，各給藥組VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)，MVD和Caspase-3、Survivin mRNA表達(dá)均降低，其中5-Fu組和健脾活血方高劑量組作用最明顯（P<0.05）。結(jié)論 健脾活血方可能通過抑制血管生成和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用抑制腫瘤生長。

關(guān)鍵詞：健脾活血方；肝癌；血管生成；細(xì)胞凋亡；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.009

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）02-0038-04

Study of Anti-tumor Effect of Jianpi Huoxue Prescription on SMMC-7721 Hepatoma Mice DONG Meng-jia1， XU You-qi2， SHEN Ming-qin3

1. Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China；

2. NO.2 Hospital of TCM of Jiangsu Province， Nanjing 210023， China；

3. Jiangsu Province Institute of Chinese Medicine， Nanjing 210028， China

Abstract： Objective To observe the effects of Jianpi Huoxue Prescription on the subcutaneous transplantation of tumor cell apoptosis and angiogenesis； To discuss its possible mechanism of action. Methods SMMC-7721 hepatoma mice models were established. 60 tumor bearing male mice were randomly divided into blank group， model group， 5-Fu group， Jianpi Huoxue Prescription high-， medium- and low-dosage groups， with 10 rats in each group. Model group and Jianpi Huoxue Prescription high-， medium- and low-dosage groups were given medicine with relevant concentrations for gavage， once a day. 5-Fu group was given 5-Fu for intraperitoneal injection every other day. The weight， tumor weight and tumor inhibitory rate of each group were compared two weeks later. The protein expressions of VEGF and VEGFR-2 were detected by immunohistochemistry， microvessel density （MVD） were calculated， and the expressions of Survivin and Caspase-3 mRNA were detected by RT-qPCR. Results Compared with model group， protein expressions of VEGF and VEGFR-2， MVD， Caspase-3 and Survivin mRNA decreased in Jianpi Huoxue Prescription high-， medium- and low-dosage groups， and the most obvious differences were in 5-Fu group and Jianpi Huoxue Prescription high-dosage group （P<0.05）. Conclusion Jianpi Huoxue Prescription can inhibit tumor growth by inhibiting angiogenesis and inducing apoptosis.

Keywords： Jianpi Huoxue Prescription； hepatoma； angiogenesis； apoptosis； mice

健脾活血方臨床用于治療肝癌，具有抑制腫瘤生長、提高生存質(zhì)量和對化療減毒增效的作用[1]。本實驗觀察健脾活血方對肝癌裸鼠皮下移植瘤模型肝癌細(xì)胞凋亡和血管生成的影響，探討其可能的作用機制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。endprint

1 實驗材料

1.1 細(xì)胞株和動物

SMMC-7721人肝癌細(xì)胞株，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；SPF級BALB/c（nu/nu）裸鼠60只，雄性，5～7周齡，體質(zhì)量18～20 g，南京沐途醫(yī)療科技有限公司，動物許可證號SYXK（蘇）2016-0010，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實驗室。

1.2 藥物及制備

健脾活血方（黃芪30 g，太子參30 g，茯苓10 g，白術(shù)10 g，山藥10 g，茵陳15 g，薏苡仁30 g，莪術(shù)15 g，石打穿15 g，半枝蓮15 g），南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院制劑中心制備，飲片浸泡2 h，煮沸后改文火煎煮15 min，紗布過濾取汁，藥渣加水再次煎煮30 min，2次藥汁混合，再濃縮并定容；氟尿嘧啶注射液（5-Fu），上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號1512161。根據(jù)人用藥劑量結(jié)合轉(zhuǎn)換公式計算裸鼠的用藥量[2]。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM不完全高糖培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶（Trysin）、磷酸鹽緩沖液（PBS），江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；組織黏合劑（德國BRAUN公司），超凈工作臺（SW-CJ-1FD，蘇州市蘇杭科技器材有限公司），CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），離心機（德國Heraeus公司），水浴鍋（GKC，通州市滬通實驗儀器廠），電子天平（Saitorius BS400S，南京天平科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 造模

取對數(shù)生長期生長良好SMMC-7721肝癌細(xì)胞株，胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，濃度為2×107個/mL，將腫瘤細(xì)胞接種于4只BALB/c（nu/nu）裸鼠右側(cè)近腋窩皮下，每只0.2 mL。當(dāng)腋下移植瘤長至直徑約10 mm時，無菌操作剝?nèi)∫浦擦?，剔除纖維包膜，將生長良好、呈淡紅色、魚肉樣的瘤組織剪切成直徑約2 mm×1 mm的小塊，勻漿后制成細(xì)胞懸液，濃度約為3×107/mL，再將腫瘤細(xì)胞接種于50只BALB/c（nu/nu）裸鼠右側(cè)近腋窩皮下，每只0.2 mL。

2.2 分組和給藥

接種成功后，將50只裸鼠隨機分為模型組、5-Fu組和健脾活血方高（73.8 g/kg）、中（36.9 g/kg）、低（18.4 g/kg）劑量組（簡稱中藥高、中、低劑量組），每組10只，于模型建立72 h后開始給藥。中藥高、中、低劑量組給藥濃度為7.4、3.7、1.85 g/mL，模型組予等量生理鹽水灌胃，給藥體積0.2 mL，每日1次，連續(xù)2周；5-Fu組予5-Fu，以生理鹽水稀釋成6 mg/mL，每次0.2 mL腹腔注射，隔日1次，連續(xù)2周。另以10只未接種的裸鼠作為空白組，正常飲食。

2.3 抑瘤率檢測

給藥第14日裸鼠禁食不禁水，第15日稱重并記錄。脫頸處死裸鼠，鈍性剝離移植瘤，生理鹽水清洗干凈，濾紙吸干，稱重并記錄，計算抑瘤率（1-給藥組平均瘤質(zhì)量÷模型組平均瘤質(zhì)量×100%）。

2.4 血管內(nèi)皮生長因子及其受體2蛋白表達(dá)測定

腫瘤組織制作蠟塊切片，按免疫組化染色試劑盒說明進行操作，DAB染色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。結(jié)果判定：蛋白陽性染色均為胞漿，包膜出現(xiàn)棕黃色及棕褐色均勻顆粒，應(yīng)用計算機MPIAS-500多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)對血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和VEGF受體2（VEGFR-2）的免疫組化染色灰度值進行定量分析和測量。

2.5 微血管密度計數(shù)

參考文獻(xiàn)[3]方法。CD34陽性以血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕色或棕黃色染色為標(biāo)準(zhǔn)；微血管技術(shù)以被染成棕黃色的單個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為1個血管計數(shù)。只要結(jié)構(gòu)部相連，其分支結(jié)構(gòu)也計做1個血管計數(shù)，只要結(jié)構(gòu)不相連，其分支結(jié)構(gòu)也計做1個血管計數(shù)。低倍鏡下（×100）觀察切片。選擇微血管分布最高密度區(qū)，然后高倍鏡下（×200）計數(shù)3個視野的微血管數(shù)。取其平均值為微血管密度（MVD）值[4]。

2.6 Caspase-3和Survivin mRNA表達(dá)檢測

抽取總RNA，按Trizol說明書進行并定量，加入1 mL總RNA提取試劑Trizol，充分混勻后用0.2 mL氯仿抽取，等體積異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌RNA，空氣干燥，加20 ?L無RNA酶水溶解。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積為20 ?L，含SYBR green燃料10 ?L（2×），Caspase-3、Survivin序列引物由南京金斯瑞科技有限公司合成。每個基因做3個復(fù)孔。PCR擴增條件：95 ℃、10 s 1個循環(huán)，95 ℃、5 s和60 ℃、20 s 45個循環(huán)。融解曲線反應(yīng)條件為：95 ℃、10 s，以0.1 ℃/s速度上升至95 ℃，排除非特異性擴增。依此檢測Caspase-3和Survivinm RNA的表達(dá)，基因表達(dá)相對定量分析采用2-ΔΔCt法。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 一般狀況

實驗過程中因灌胃過程損傷胃和食管、操作過程中注射感染以及自身腫瘤消耗致部分裸鼠死亡，其中中藥低劑量組給藥第4、7日各死亡1只，中藥中劑量組給藥第7、8、11日各死亡1只，5-Fu組給藥第11、13日各死亡1只。給藥第12日，模型組裸鼠出現(xiàn)生命衰竭癥狀，周身消瘦，弓背狀，肋骨可見，遂于第14日脫頸處死動物。

4.2 健脾活血方對裸鼠皮下移植瘤質(zhì)量的影響

與模型組比較，空白組和中藥中、高劑量組裸鼠給藥后體質(zhì)量增加（P<0.05）；與模型組比較，中藥高劑量組和5-Fu組瘤質(zhì)量明顯降低（P<0.05），其抑廇作用明顯。結(jié)果見表1。endprint

4.3 健脾活血方對裸鼠瘤組織血管內(nèi)皮生長因子及其受體2蛋白表達(dá)的影響

與模型組比較，各給藥組VEGF及VEGFR-2蛋白表達(dá)均降低，其中5-Fu組和中藥高劑量組作用最明顯（P<0.05）。結(jié)果見表2。

4.4 健脾活血方對裸鼠瘤組織微血管密度的影響

與模型組比較，各給藥組MVD均降低，其中5-Fu組和中藥高劑量組降低最明顯（P<0.05）。結(jié)果見表3。

4.5 健脾活血方對裸鼠瘤組織Caspase-3、Survivin mRNA表達(dá)的影響

與模型組比較，各給藥組Caspase-3和Survivin mRNA表達(dá)均升高，其中5-Fu組和中藥高劑量組作用最明顯（P<0.05）。結(jié)果見表4。

5 討論

本研究建立裸鼠肝癌SMMC-7721細(xì)胞實體瘤移植模型，考察了健脾活血方對裸鼠體質(zhì)量及瘤質(zhì)量的影響。其中5-Fu組裸鼠平均體質(zhì)量明顯低于其他各組裸鼠，推測其原因可能是5-Fu為抗代謝類抗腫瘤藥，并且可引起消化道不適的癥狀，影響裸鼠進食狀態(tài)。從各給藥組抑瘤率來看，中藥高劑量組與5-Fu組相近，顯示健脾活血方對肝癌裸鼠具有一定的增加體質(zhì)量和抑制腫瘤生長的作用。

肝臟為雙重血供的器官，肝癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移都與血管生成關(guān)系密切，VEGF是抗肝癌血管生成藥物治療的重要靶點[5]。VEGF信號通路是調(diào)控新生血管的關(guān)鍵信號通路，VEGF及其受體是較強的促血管生成因子，被認(rèn)為與誘導(dǎo)腫瘤微血管生成密切相關(guān)[6]。同時，實驗選用反映腫瘤血管生成情況最理想的MVD作為指標(biāo)，結(jié)果顯示，健脾活血方對肝癌MVD、VEGF和VEGFR-2具有明顯的下調(diào)作用，并與藥物濃度呈正相關(guān)，表明健脾活血方可能通過作用于VEGF和VEGFR-2這2個靶點，實現(xiàn)控制血管生成，達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。

Surivivin作為凋亡抑制基因，定位于人染色體17q25，處于細(xì)胞凋亡途徑的中心地位，研究發(fā)現(xiàn)其致病機制可能是調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路，并通過直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性來抑制細(xì)胞凋亡[7]。同時可以上調(diào)VEGF的表達(dá)，參與腫瘤血管形成，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[8-9]。Caspase是細(xì)胞凋亡過程中期重要作用的蛋白酶家族，Caspase-3是其中關(guān)鍵的蛋白酶，所介導(dǎo)的蛋白剪切是細(xì)胞凋亡機制的最重要部分之一。相關(guān)實驗顯示，Caspase-3和Survivin可能共同參與肝細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡過程的調(diào)節(jié)，并且二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[10]。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，健脾活血方可顯著降低肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡抑制基因Surivivin，提高Caspase-3 mRNA的表達(dá)，這可能是健脾活血方誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長的主要機制之一。

綜上所述，本實驗結(jié)果顯示，健脾活血方可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抗血管生成實現(xiàn)抗腫瘤作用，為健脾活血方在臨床的應(yīng)用提供了一定的實驗依據(jù)。

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