韓何丹 王 海 高麗萍*

（1. 北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京100023；2. 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100023）

順鉑(cisplatin，DDP)作為第1個(gè)鉑類藥物目前依舊是腫瘤化療的常用藥物，無論是單獨(dú)施藥還是和其他藥物聯(lián)用都表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用，它對睪丸癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、惡性淋巴瘤和軟組織肉瘤等均有較好療效，且抗腫瘤效果與劑量使用呈現(xiàn)一定的關(guān)系[1-4]。但順鉑在臨床治療上常伴隨有一定的毒副作用，并隨著使用劑量的增加順鉑的毒副作用也越來越明顯，這些毒副作用包括惡心、嘔吐、骨髓抑制引起的過敏反應(yīng)、腎毒性、心臟毒性等，其中腎毒性是限制順鉑臨床使用劑量的主要原因[5-7]。DDP腎毒性的表現(xiàn)形式多種多樣，包括從可逆的急性腎功能損傷到伴有顯著的腎組織學(xué)改變的不可逆慢性腎功能衰竭[8]。因此，減輕DDP腎毒性顯得尤為重要。

實(shí)驗(yàn)研究表明使用一些天然產(chǎn)物或合成抗氧化劑可有效減輕順鉑的毒副作用，如葡萄籽原花青素，在體內(nèi)抗氧化及消除自由基的能力是維生素C的20倍，Yousef等[9]發(fā)現(xiàn)葡萄籽原花青素能夠降低DDP誘導(dǎo)的機(jī)體各組織中硫代巴比妥酸反應(yīng)物的水平，提高抗氧化酶的活性以及谷胱甘肽和總蛋白來對抗順鉑腎毒性；El-Sayed等[10]研究表明肉毒堿可以通過提高心肌組織中的抗氧化水平來拮抗順鉑引發(fā)的大鼠血清心肌酶譜變化，改善心肌氧化損傷。因此，尋找合適的抗氧化物質(zhì)用于臨床減輕順鉑毒副作用有很重要的意義[11-13]。

大蒜素(allicin)是從大蒜頭中提取的一種天然有機(jī)硫化合物，學(xué)名二烯丙基硫代亞磺酸酯，結(jié)構(gòu)式為CH2=CHCH2S(O)SCH2CH=CH2。大蒜素常應(yīng)用于臨床治療中，藥物動(dòng)力學(xué)與流行病學(xué)研究表明，大蒜素對肝癌、肺癌等腫瘤有較好的療效，且大蒜素還具有抑菌、抗氧化、提高免疫力、降低血壓、血脂等廣泛的生物學(xué)活性[14-15]。目前國內(nèi)關(guān)于大蒜素對順鉑腎毒性影響的研究仍處于起步階段，大蒜素減輕DDP所致腎損傷的具體原因尚不清楚。為此，本課題以人胚腎細(xì)胞(human embryonic kidney 293 cell，HEK293)為研究對象，對大蒜素拮抗DDP腎毒性的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HEK293細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞中心；DDP(注射用粉劑)購自齊魯制藥公司(無菌生理鹽水溶解)；大蒜素(純度≥90%)由生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提取(無水乙醇溶解后雙蒸水稀釋，大蒜素工作液乙醇含量＜0.1%)；胎牛血清購自Hyclone公司；DMEM培養(yǎng)基胰酶、雙抗均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；四甲基偶氮噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，購自美國Sigma公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathion，GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有15%新生胎牛血清和雙抗(100 μg/mL鏈霉素，100 U/mL青霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱環(huán)境為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、飽和濕度。待細(xì)胞匯合度至80%～90%時(shí)，用胰酶消化，1∶3進(jìn)行傳代，每隔1 d換一次培養(yǎng)基，每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞活力

1.3.1 DDP對HEK293細(xì)胞的毒性作用 將100 μL (濃度為1×105/mL) 的HEK293細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞生長到匯合狀態(tài)，加入終濃度分別為0、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 mg/L的DDP，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱孵育24 h，然后加入終濃度為0.5 mg/mL MTT，繼續(xù)孵育4 h，棄上清后每孔加入DMSO 150 μL，混合均勻，570 nm處檢測吸光度D(570)值，以未添加DDP組作為空白對照孔，細(xì)胞抑制率計(jì)算方法：細(xì)胞抑制率=1-D(570)實(shí)驗(yàn)組/ D(570)對照組，并計(jì)算DDP對HEK293細(xì)胞的LD50值，由此確定DDP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞損傷模型的最佳使用濃度。

1.3.2 大蒜素作用后HEK293細(xì)胞的存活率 處理方法同上，大蒜素終濃度依次為0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 mg/L，細(xì)胞生長存活率計(jì)算方法：

1.3.3 大蒜素對DDP所致HEK293細(xì)胞毒性作用的影響 將100 μL(濃度為1×105/mL)處于生長期的細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞生長至匯合狀態(tài)時(shí)，加藥處理。試驗(yàn)分4組：①對照組，未加入DDP和大蒜素；②DDP組，HEK293細(xì)胞DDP濃度為20 mg/L；③大蒜組+DDP，在加DDP前24 h分別加入不同濃度大蒜素(1、2、3、4、5、6、7、8 mg/L)孵育細(xì)胞。不加藥的組在加藥時(shí)加入相應(yīng)體積的溶劑做為對照。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，在 37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h測定細(xì)胞存活率。

1.4 HEK293細(xì)胞蛋白濃度測定及細(xì)胞內(nèi)GSH、SOD、MDA的測定

細(xì)胞分為4個(gè)組：①正常對照組，未加入DDP和大蒜素；②大蒜素保護(hù)組，加入2 mg/L大蒜素；③DDP模型組，加入20 mg/L DDP；④大蒜素和DDP 聯(lián)合處理組，加入4 mg/L大蒜素和20 mg/L DDP；將2 mL(濃度為1×105/mL)處于生長期的細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時(shí)，按照實(shí)驗(yàn)分組加藥處理。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后除去培養(yǎng)液，PBS洗一遍，每孔加入300 μL PBS，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞后，將裝有細(xì)胞懸液的離心管放在冰水浴中，用細(xì)胞破碎儀破碎1 min；取勻漿液12 000 r/min離心10 min，收集上清液，按照測試盒說明進(jìn)行操作，測定細(xì)胞蛋白濃度，并采用黃嘌呤氧化酶法檢測各組細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活力，硫代巴比妥酸法測定細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量，二硫代二硝基苯甲酸法測定還原型谷胱甘肽(GSH)的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 DDP對HEK293細(xì)胞的毒性作用

DDP對HEK293細(xì)胞存活率的影響見圖1，不同濃度的DDP作用于HEK293細(xì)胞24 h后，對細(xì)胞生長有不同程度的抑制作用。隨著DDP濃度不斷升高，細(xì)胞抑制率逐漸升高，且呈現(xiàn)劑量依賴性。由SPSS統(tǒng)計(jì)分析得出，DDP對HEK293的半數(shù)致死劑量(LD50)為19.78 mg/L，其中，20 mg/L是與半數(shù)致死劑量最為接近的整數(shù)濃度，為提高后續(xù)試驗(yàn)的效率，選擇將其作為建立DDP損傷模型的濃度。

圖1 不同濃度DDP對HEK293細(xì)胞生長抑制率的影響(n=6)

2.2 大蒜素對HEK293細(xì)胞存活率的影響

大蒜素對HEK293細(xì)胞存活率的影響見圖2，不同濃度的大蒜素作用于HEK293細(xì)胞24 h后，對細(xì)胞存活率有不同程度的影響。在一定范圍內(nèi)(0～2 mg/L)細(xì)胞存活率隨大蒜素濃度的增加而逐漸升高，且與正常對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。大蒜素濃度為2 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率最高，當(dāng)濃度大于最佳生長濃度時(shí)，細(xì)胞存活率逐漸下降，當(dāng)大蒜素濃度高于16 mg/L時(shí)，可顯著抑制HEK293細(xì)胞的生長(P＜0.01)。由此說明，大蒜素對HEK293細(xì)胞的影響具有“低濃度促進(jìn)，高濃度抑制”的特點(diǎn)。

圖2 不同濃度大蒜素對HEK293細(xì)胞存活率的影響(n=6)

2.3 大蒜素對DDP所致HEK293細(xì)胞毒性的影響

大蒜素對DDP引起的細(xì)胞毒性的影響見圖3，用終濃度為20 mg/L的DDP作用HEK293細(xì)胞24 h建立細(xì)胞損傷模型。和DDP組相比，當(dāng)大蒜素濃度為4 mg/L，細(xì)胞存活率最高，當(dāng)濃度高于4 mg/L，大蒜素的減毒作用逐漸減小，提示在一定濃度范圍內(nèi)大蒜素對DDP誘發(fā)的HEK293細(xì)胞毒性有顯著的保護(hù)作用。

2.4 大蒜素對DDP作用后的HEK293細(xì)胞內(nèi)GSH含量、MDA含量和SOD活力的影響

大蒜素對DDP作用后的細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響見圖4，DDP作用于HEK293細(xì)胞24 h，GSH含量[(25.28±4.09) μmol/g]較正常對照組[(72.11±6.32) μmol/g]顯著降低(P＜0.01)，經(jīng)大蒜素提前24 h孵育后，該組GSH含量[(50.31± 8.80) μmol/g]較 DDP組 顯 著 升 高 (P＜0.01)，SOD活力也有類似的效果。DDP造成細(xì)胞MDA含量[(0.64± 0.10) nmol/mg]較 正 常 對 照 組 [(0.38± 0.06)nmol/mg]顯著升高(P＜0.01)，而大蒜素干預(yù)后，相對于DDP組 ， MDA含 量 [(0.51± 0.08) nmol/mg]顯 著 降 低(P＜0.01)。結(jié)果表明，大蒜素對DDP造成的細(xì)胞氧化損傷有一定的保護(hù)作用。

圖4 大蒜素對DDP所致細(xì)胞抗氧化指標(biāo)變化的影響(n=3)

3 討論

很多研究證實(shí)了順鉑所致機(jī)體毒副作用中氧化應(yīng)激的重要性。順鉑所致腎毒性和腎組織中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增多密切相關(guān)[16-18]，該藥能引起活性氧類物質(zhì)的產(chǎn)生如超氧化物陰離子、羥基自由基等。也有報(bào)道稱，以順鉑為基礎(chǔ)的化療會(huì)引起病人血漿中的各種抗氧化物質(zhì)濃度降低，這種情況會(huì)使“機(jī)體通過抗氧化機(jī)制對抗自由基引起的器官損傷、基因毒害”的預(yù)防方案失敗，從而會(huì)進(jìn)一步引起正常組織的癌變[19]。然而，順鉑所致毒性的準(zhǔn)確機(jī)制尚不清楚，明確這些機(jī)制有助于開發(fā)新的保護(hù)措施。

日本學(xué)者藤田勛早在2006年便提出-S(O)S-CH2-CH=CH-基團(tuán)是大蒜素的抗氧化活性部位，烯丙基位的氫與抗氧化活性有關(guān)[20]。已經(jīng)證實(shí)大蒜素的抗氧化活性還歸因于巰基(-SH)的修飾作用[21]。自由基學(xué)說認(rèn)為，導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷的罪魁禍?zhǔn)资亲杂苫?，機(jī)體在代謝過程中不斷產(chǎn)生諸如二苯代苦味酸基自由基(DPPH·)、羥自由基(·OH)以及超氧自由基(O2-.)等，研究表明，大蒜素對各類自由基具有清除作用，可降低機(jī)體的氧化水平。García-Trejo等[22]通過建立大鼠慢性腎病模型研究大蒜素對高血壓和心臟功能的影響，結(jié)果表明大蒜素治療可降低高血壓、改善腎和心臟功能障礙，大蒜素還能增強(qiáng)抗氧化酶活性，減少氧化應(yīng)激作用。另外，大蒜素可通過激活GSH的合成來抑制腫瘤細(xì)胞的生長，具體表現(xiàn)為GSH可將細(xì)胞毒素迅速分解[23]。而作為細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化劑之一，GSH在清除自由基、維持細(xì)胞膜通透性、保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮重要作用。除此之外，GSH還對DNA的合成進(jìn)行調(diào)節(jié)。Helen等[24]對尼古丁導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化作用的小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大蒜素能明顯增強(qiáng)小鼠抵抗尼古丁脂質(zhì)過氧化作用，這是因?yàn)樾∈蠓么笏馑睾?，抗氧化物酶活性增?qiáng)，且GSH得到積累。本研究結(jié)果表明，DDP導(dǎo)致HEK293細(xì)胞GSH含量顯著降低，而大蒜素則能夠明顯提高GSH含量，提示大蒜素對DDP造成的細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。

順鉑進(jìn)入機(jī)體后誘發(fā)產(chǎn)生的大量自由基等活性氧類物質(zhì)，氧自由基不但通過生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化引起細(xì)胞損傷，而且還能通過脂質(zhì)過氧化物的分解產(chǎn)物造成細(xì)胞損傷。MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的一種重要代謝產(chǎn)物，其含量增加會(huì)破壞細(xì)胞膜。SOD是一種金屬蛋白，能夠清除氧自由基，從而保護(hù)細(xì)胞免受超氧化物自由基的損傷[25]。SOD活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。因此，二者結(jié)合的測定結(jié)果可評價(jià)細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)。本研究結(jié)果表明DDP可誘發(fā)細(xì)胞SOD活性降低，這是DDP直接與SOD活力點(diǎn)巰基基團(tuán)結(jié)合所致[26]，也可能是由于DDP誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生的NO可與超氧化物陰離子反應(yīng)生成超氧亞硝基陰離子，后者能抑制SOD的活性。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)4 mg/L的大蒜素干預(yù)后，相對于DDP模型組，細(xì)胞SOD活力提高35.8%，MDA含量降低23.9%，說明大蒜素能夠清除超氧化物陰離子等自由基，減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕DDP引起的氧化應(yīng)激，從而拮抗DDP腎毒性。

本研究結(jié)果表明，在一定濃度范圍大蒜素能夠提高細(xì)胞存活率，大蒜素預(yù)處理可顯著提高順鉑導(dǎo)致的HEK293細(xì)胞的抗氧化水平的降低，提示大蒜素對順鉑腎毒性具有明顯的保護(hù)作用。

[1] ABRAMS T J，LEE L B，MURRAY L J，et al. SU11248 inhibits KIT and platelet-derived growth factor receptor β in preclinical models of human small cell lung cancer[J]. Mol Cancer Ther，2003，2(5)：471-478.

[2] MAURMANN L，BELKACEMI L，ADAMS N R，et al. A novel cisplatin mediated apoptosis pathway is associated with acid sphingomyelinase and FAS proapoptotic protein activation in ovarian cancer[J]. Apotosis，2015，20(7)：960-974.

[3] CHAU C，WHEATER M，GELDART T，et al. Clinical outcomes following neoadjuvant cisplatin-based chemotherapy for bladder cancer in elderly compared with younger patients[J].Eur J Cancer Care(Engl)，2015，24(2)：155-162.

[4] PRABHAKARAN P，HASSIOTOU F，BLANCAFORT P，et al. Cisplatin induces differentiation of breast cancer cells[J].Front Oncol，2013，3：134.

[5] 鄧成艷，黃榮麗，連利娟，等. 順鉑的毒副作用及其防治[J].中華婦產(chǎn)科雜志，1995，30(5) ：376-379．

[6] KINTZEL P E. Anticancer drug-induced kidney disorders[J].Drug Saf，2001，24(1)：19-38.

[7] RABIK C A，DOLAN M E. Molecular mechanisms of resistance and toxicity associated with platinating agents[J]. Cancer Treat Rev，2007，33(1)：9-23.

[8] 孫家躍. 順鉑腎毒性機(jī)制及防護(hù)方法的研究進(jìn)展[J]. 中國醫(yī)院用藥評價(jià)與分析，2010，10(5)：478-480.

[9] YOUSEF M I，SAAD A A，EI-SHENNAWY L K. Protective effect of grape seed proanthocyanidin extract against oxidative stress induced by cisplatin in rats[J]. Food Chem Toxicol，2009，47(6)：1176-1183．

[10] EL-SAYED E，EL-AWADY，YASSER M，et al. Cisplatineinduced cardio toxicity：mechanisms and cardio protective strategies[J]. Eur J Pharmacol，2011，650：335-341．

[11] ALI B H，AL MOUNDHRI M S. Agents ameliorating or augmenting the nephrotoxicity of cisplatin and other platinum compounds：a review of some recent research[J]. Food Chem Toxicol，2006，44：1173-1183.

[12] SAHU B D，RENTAM K K，PUTCHA U K，et al. Carnosic acid attenuates renal injury in an experimental model of rat cisplatin-induced nephrotoxicity[J]. Food Chem Toxicol，2011，49(12)：3090-3097.

[13] SANDEEP D，KRISHNAN NAIR C K. Amelioration of cisplatin-induced nephrotoxicity by extracts of Hemidesmus indicus and Acorus calamus[J]. Pharm Biol，2010，48(3)：290-295.

[14] 李娜. 大蒜的功效成分及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 中國食物與營養(yǎng)，2007，11：25-27.

[15] 徐巍，蘇樂群，李宏建. 大蒜素的研究進(jìn)展[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，06：115-121.

[16] ANTUNES L M，DARIN J D，BIANCHI M D. Protective effects of vitamin C against cisplatin-induced nephrotoxicity and lipid peroxidation in adult rats：a dose-dependent study[J].Pharmacol Res，2000，41(4)：405-411．

[17] KARTHIKEYAN K， BAI B R， DEVARAJ S N.Cardioprotective effect of grape seed proanthocyanidins on isoproterenol-induced myocardial injury in rats[J]．Int J Cardiol，2007，115(3)：326-333.

[18] SATOH M，KASHIHARA N，F(xiàn)UJIMOTO S，et al. A novel free radical scavenger，edarabone，protects against cisplatininduced acute renal damage in vitro and in vivo[J]. J Pharmacol Exp Ther，2003，305(3)：1183-1190.

[19] WOZNIAK K，CZECHOWSKA A，BLASIAK J. Cisplatinevoked DNA fragmentation in normal and cancer cells and its modulation by free radical scavengers and thetyrosine kinase inhibitor STI571[J]. Chem Biol Interact，2004，147(3)：309-318.

[20] 賀玉琢.日本藥學(xué)會(huì)第124次年會(huì)論文摘要[J].國外醫(yī)學(xué)(中醫(yī)中藥分冊)，2005，2：115-121.

[21] PRASAD K，LAXDAL V A，YU M，et al. Antioxidant activity of allicin，an active principle in garlic[J]. Mol Cell Biochem，1995，148(2)：183-189.

[22] GARCíA-TREJO E M，ARELLANO-BUENDíA A S，ARGü ELLO-GARCíA R，et al. Effects of allicin on hypertension and cardiac function in chronic kidney disease[J]. Oxid Med Cell Lar Longev，2016，2016：3850402.

[23] 蔣淑婉，李云，陳鶴. 大蒜素的抗腫瘤作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2013，19(08)：1420-1422.

[24] HELEN A，RAJASREE C R，KRISHNAKUMAR K，et al.Antioxidant role of oils isolated from garlic (Allium sativum Linn)and onion (Allium cepa Linn) on nicotine-induced lipid peroxidation[J]. Vet Hum Toxicol，1999，41(5)：316-319.

[25] YILDIRIM Z，SOGUT S，ODACI E，et al. Oral erdosteine administration attenuates cisplatin-induced renal tubular damage in rats[J]. Pharmacol Res，2003，47(2)：149-156.

[26] ZHANG J G，ZHONG L F，ZHANG M，et al. Protection effects of procaine in oxidative stress and toxicities of renal oortical sfices from rats caused by eisplatin in vitro[J]. Arch Toxicol，1992，66(5)：354-358.