孫貝蕾鄭宇瓊 林玲陳瑋瑩蔡爾慧 * 陳瑋芳*

（1. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，廣東 汕 頭 515041；2. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣東 汕 頭 515041；3. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，廣東 汕 頭 515041）

人體皮膚表皮基底層的黑素細(xì)胞由早期胚胎階段神經(jīng)嵴分化而成，具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和功能[1]。黑素細(xì)胞重要的功能是合成黑素，這種產(chǎn)物不僅賦于不同人皮膚、頭發(fā)和眼睛顏色的不同，而且對(duì)于機(jī)體抵御紫外光照射引起的損傷起著重要作用[2]。

黑素細(xì)胞中黑素合成過(guò)程需要相關(guān)的酶，包括酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)，酪氨酸酶相關(guān)蛋白(tyrosinase related protein-1，TYRP-1)和多巴色素異構(gòu)酶(DOPA chrome tautomerase，DCT)，其中的TYR是關(guān)鍵酶，黑素合成量取決于該酶的含量和活性大小。黑素細(xì)胞中合成的黑素以黑素體形式被轉(zhuǎn)運(yùn)。黑素相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)ab27a是一種小分子G蛋白，這種蛋白可通過(guò)其C末端固定于黑素體膜，并和黑素親和素蛋白(melanophilin)、肌球蛋白Va(myosinVa)構(gòu)成三聯(lián)分子復(fù)合物[3]，參與黑素細(xì)胞中黑素體的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。皮膚色素代謝異常與黑素細(xì)胞黑素的合成和黑素體轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程密切相關(guān)[4]。

中藥白芷制劑可應(yīng)用于臨床某些皮膚色素紊亂性疾病如白癜風(fēng)、銀屑病等的治療[5-7]。但由于白芷的化學(xué)成分復(fù)雜，其治療色素紊亂性疾病的作用機(jī)制目前尚不明確。白芷含有活性成分呋喃香豆素類(lèi)化合物，主要有歐前胡素(imperaterin)、異歐前胡素(isoimperaterin)等成分。我們前期的研究探討白芷的活性成分歐前胡素對(duì)黑素細(xì)胞的作用，結(jié)果表明歐前胡素抑制體外培養(yǎng)人表皮黑素細(xì)胞TYR活性并促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白R(shí)ab27a表達(dá)，降低黑素細(xì)胞中黑素的含量[8]。目前異歐前胡素應(yīng)用于抗炎方面有一些相關(guān)的報(bào)道[9-10]，但對(duì)于體外人表皮黑素細(xì)胞的作用尚不明確。本研究擬探討異歐前胡素對(duì)體外培養(yǎng)人表皮黑素細(xì)胞TYR和Rab27a及黑素細(xì)胞中黑素含量的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

異歐前胡素化學(xué)名為4-(3-甲基丁-2-烯氧基)呋喃并[3，2-g]苯并吡喃-7-酮；分子式為C16H14O4；相對(duì)分子質(zhì)量為270.28，純度99.9%。中國(guó)食品藥品檢定研究院產(chǎn)品(編號(hào)110827-200712)，化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 異歐前胡素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人表皮黑素細(xì)胞的體外分離與純化培養(yǎng)體外人表皮黑素細(xì)胞從5例年齡為7～20歲健康兒童或青少年包皮環(huán)切術(shù)切除的新鮮皮膚組織中分離和純化培養(yǎng)，皮膚標(biāo)本取自汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 (經(jīng)知情同意)。本研究方案經(jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。人表皮黑素細(xì)胞的體外分離和純化培養(yǎng)按我們前期研究的方法[11]：取新鮮皮膚組織，PBS清洗，剪成大小約2 mm×10 mm條狀，置于1.6 U/mL Dispase II(Gibco，USA) 中4 ℃消化過(guò)夜，分離表皮，置于0.25%胰酶-0.02% EDTA中消化，過(guò)濾細(xì)胞懸液，離心去上清，加入含人表皮黑素細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HMGS)的M-254培養(yǎng)基(Gibco，USA)，調(diào)整細(xì)胞濃度后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，置37 ℃、CO體積分?jǐn)?shù)為2 5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d更換M-254培養(yǎng)基1次，胰酶差異法純化和傳代培養(yǎng)人表皮黑素細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)使用第3～5代純化培養(yǎng)的人表皮黑素細(xì)胞。

1.2.2 MTT法測(cè)定黑素細(xì)胞活力 MTT法測(cè)定黑素細(xì)胞活力[12]：調(diào)整黑素細(xì)胞濃度為5×104/mL，接種于96孔板，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使黑素細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。將黑素細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組僅加入M-254培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入含25 μmol/L異歐前胡素的M-254培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)48 h后每孔加入5 mg/mL 四甲基噻唑藍(lán)(MTT)(Amresco，USA) 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入150 μL DMSO，室溫避光震蕩10 min。置酶標(biāo)儀(Wellscan K3，KHB labsystems，F(xiàn)inland)測(cè)定吸光度D(492)值，數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件分析。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)TYR和Rab27a蛋白按1.2.2方法培養(yǎng)兩組黑素細(xì)胞48 h后分別收集細(xì)胞，加30 μL RIPA裂解液(Pierce，USA)(臨用時(shí)添加PMSF 10 μL，蛋白酶抑制劑2 μL)提取細(xì)胞總蛋白。BCA法定量細(xì)胞總蛋白。各取50 μg樣品蛋白，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜[13]。TYR檢測(cè)一抗加入1∶1 000鼠抗人酪氨酸酶單克隆抗體(Abcam，USA)，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)ab27a檢測(cè)一抗加入1∶ 200鼠 抗 人 Rab27a抗 體 (Abcam， USA)， 內(nèi) 參 照GAPDH蛋白的檢測(cè)一抗加入1∶4 000鼠抗人GAPDH單克隆抗體(中杉金橋)，4 ℃搖床過(guò)夜。第2天分別加入適當(dāng)稀釋的二抗HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(碧云天)，室溫孵育1 h，加入1∶1 ECL化學(xué)發(fā)光液A、B液，置于SynGene Genius凝膠成像系統(tǒng)，X光片曝光成像，采用美國(guó)Bio-Rad Quantity One軟件分析圖像灰度值，數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5軟件分析。

1.2.4 黑素細(xì)胞TYR活力測(cè)定 黑素細(xì)胞TYR活力的測(cè)定采用L-多巴氧化法[14]。各組細(xì)胞按1.2.2的條件培養(yǎng)48 h后，每孔加入 1% Triton X-100溶液80 μL作用5 min，再加入0.1% L-DOPA溶液20 μL，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度D(492)值，數(shù)據(jù)分析采用美國(guó)GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件。

1.2.5 黑素細(xì)胞黑素含量測(cè)定 黑素含量測(cè)定采用NaOH法[15]，操作如下：調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞濃度為1×105/mL，接種于6孔板，分組培養(yǎng)同1.2.4，經(jīng)0.25%胰酶-0.02% EDTA消化后離心棄上清，加入240 μL含10%DMSO的1 mol/L NaOH溶解1 min，80 ℃水浴30 min。置于酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度D(492)值，按以下公式計(jì)算黑素含量。

黑素的相對(duì)含量=D(492)實(shí)驗(yàn)組/D(492)對(duì)照組×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用t檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 異歐前胡素對(duì)黑素細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡下觀察人表皮黑素細(xì)胞的形態(tài)結(jié)果如圖2?？梢?jiàn)對(duì)照組人表皮黑素細(xì)胞胞體較大，呈梭形、三角形或菱形，細(xì)胞折光性好，有2～4個(gè)樹(shù)狀突起(圖2A)；實(shí)驗(yàn)組人表皮黑素細(xì)胞的胞體變小，但樹(shù)狀突起變長(zhǎng)(圖2B)。

圖2 倒置顯微鏡觀察人表皮黑素細(xì)胞的形態(tài)(×200)

2.2 異歐前胡素抑制表皮黑素細(xì)胞活力

MTT法測(cè)定黑素細(xì)胞活力結(jié)果如圖3，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組黑素細(xì)胞的活力分別為100%、82.8%。表明25 μmol/L異歐前胡素作用后，實(shí)驗(yàn)組黑素細(xì)胞的活力較對(duì)照組降低了17.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示25 μmol/L異歐前胡素可抑制表皮黑素細(xì)胞的活力。

圖3 MTT法檢測(cè)人表皮黑素細(xì)胞的活力

2.3 異歐前胡素對(duì)TYR和Rab27a蛋白表達(dá)的影響

Western blot法檢測(cè)黑素細(xì)胞TYR和Rab27a蛋白表達(dá)的結(jié)果見(jiàn)圖4A。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組黑素細(xì)胞TYR的表達(dá)降低30.3%(P＜0.01)，而實(shí)驗(yàn)組黑素細(xì)胞Rab27a蛋白的表達(dá)升高31.9%(P＜0.05)(圖4B)。提示25 μmol/L異歐前胡素對(duì)黑素細(xì)胞TYR表達(dá)具有抑制作用，而對(duì)黑素細(xì)胞Rab27a蛋白表達(dá)則呈促進(jìn)作用。

2.4 異歐前胡素對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性和黑素含量的作用

結(jié)果見(jiàn)表1。25 μmol/L異歐前胡素作用48 h后，實(shí)驗(yàn)組黑素細(xì)胞TYR活性較對(duì)照組降低了25.6%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示25 μmol/L異歐前胡素對(duì)體外黑素細(xì)胞TYR活性具有明顯抑制作用。黑素的含量比對(duì)照組降低30.9%，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 異歐前胡素對(duì)人表皮黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性和黑素含量的作用(n=3)

圖4 異歐前胡素對(duì)人表皮黑素細(xì)胞TYR和Rab7a蛋白表達(dá)的影響

3 討論

異歐前胡素是中藥白芷的主要活性成分之一，屬于呋喃香豆素類(lèi)化合物。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中測(cè)定0、12.5、25、50和100 μmol/L等不同濃度異歐前胡素對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響，結(jié)果表明，12.5 μmol/L異歐前胡素作用對(duì)于黑素細(xì)胞酪氨酸酶的活性影響不明顯，25 ～100 μmol/L異歐前胡素抑制黑素細(xì)胞酪氨酸酶的活性，但50 和100 μmol/L異歐前胡素可引起不同程度的細(xì)胞死亡。故本研究選用最適濃度25 μmol/L異歐前胡素開(kāi)展研究，結(jié)果表明，25 μmol/L異歐前胡素作用于體外培養(yǎng)的人表皮黑素細(xì)胞，使黑素細(xì)胞的樹(shù)狀突起變長(zhǎng)；并抑制人表皮黑素細(xì)胞的活力；抑制黑素細(xì)胞TYR表達(dá)和TYR活性；促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白R(shí)ab27a的表達(dá)，降低黑素細(xì)胞中黑素的含量。

人體皮膚的顏色主要取決于黑素細(xì)胞的數(shù)量、黑素的含量、黑素體的分布和轉(zhuǎn)移[4]，皮膚色素異常相關(guān)疾病與這些代謝過(guò)程的障礙密切相關(guān)。異歐前胡素作為中藥白芷的主要活性成分，通過(guò)抑制黑素細(xì)胞的活力、抑制TYR的表達(dá)和TYR活性等作用過(guò)程，減少黑素細(xì)胞黑素合成；并通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白R(shí)ab27a的表達(dá)，促進(jìn)黑素細(xì)胞中黑素的轉(zhuǎn)運(yùn)，降低黑素細(xì)胞黑素含量。本研究結(jié)果可從代謝層面闡明中藥白芷應(yīng)用于皮膚色素紊亂性疾病治療的作用機(jī)制。

Kawasaki等[16]的研究表明，黑素細(xì)胞樹(shù)狀突起的數(shù)量及長(zhǎng)度增加，有利于黑素小體的轉(zhuǎn)運(yùn)和分布，在樹(shù)狀突起較長(zhǎng)的細(xì)胞中Rab27a的表達(dá)也有所增加。本研究中異歐前胡素使黑素細(xì)胞的樹(shù)狀突起變長(zhǎng)，并促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白R(shí)ab27a蛋白的表達(dá)，降低黑素細(xì)胞黑素含量，表明Rab27a蛋白的表達(dá)增強(qiáng)有利于黑素細(xì)胞黑素體的轉(zhuǎn)運(yùn)。我們的前期研究表明，白芷的另一活性成分歐前胡素也有促進(jìn)Rab27a蛋白表達(dá)的作用，但使黑素細(xì)胞的樹(shù)狀突起變短[8]，提示歐前胡素和異歐前胡素對(duì)于黑素細(xì)胞黑素體轉(zhuǎn)運(yùn)和分布的作用存在一定差異。另外，異歐前胡素可促進(jìn)黑素細(xì)胞β-actin的表達(dá)，由于β-actin是細(xì)胞骨架微絲的主要構(gòu)成成分，異歐前胡素使黑素細(xì)胞樹(shù)狀突起的變長(zhǎng)可能與β-actin的表達(dá)增強(qiáng)密切相關(guān)[17]，

黑素細(xì)胞中黑素小體轉(zhuǎn)移的過(guò)程需要一些重要的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白，主要有Rab27a、黑素親和素蛋白和肌球蛋白Va等。Rab27a是一種小分子G 蛋白，可作為肌球蛋白Va識(shí)別黑素小體的受體，通過(guò)其C末端固定于黑素小體膜；黑素親和素蛋白作為連接器，以其N(xiāo)-端連接已結(jié)合GTP的Rab27a，并以其C-端結(jié)合于肌球蛋白Va的C-端；肌球蛋白Va的N-端為動(dòng)力區(qū)，可結(jié)合肌動(dòng)蛋白微絲，并水解ATP提供動(dòng)力。這3種蛋白質(zhì)組成復(fù)合物，介導(dǎo)黑素細(xì)胞中黑素小體的轉(zhuǎn)運(yùn)[3]。有關(guān)異歐前胡素對(duì)于黑素親和素蛋白和肌球蛋白Va 蛋白的作用，仍有待于進(jìn)一步研究加以闡明。

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