李 斐

變應(yīng)性鼻炎是機(jī)體接觸過(guò)敏原后所發(fā)生的由特異性抗體lgE介導(dǎo)，發(fā)生在鼻腔或鼻黏膜的，致肥大細(xì)胞致敏性增加的慢性變態(tài)反應(yīng)性疾病[1],與哮喘有關(guān)[2]。鼻腔黏膜腺體中分泌物和大分子氣體對(duì)氣道內(nèi)表面液體平衡保持和細(xì)菌入侵抵御有重要作用[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，香菊片治療慢性鼻炎、鼻竇炎等效果較好[5]，但對(duì)于其調(diào)節(jié)變應(yīng)性鼻炎血清細(xì)胞因子和維持纖毛系統(tǒng)正常功能的研究較少。本研究探討香菊片對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜及鼻纖毛變化的影響，觀察IgE、白介素-4(IL-4)、IL-8水平。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 香菊片購(gòu)于陜西香菊制藥有限公司，卵清蛋白(OVA)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，其他試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。挑選健康清潔級(jí)健康Wistar大鼠30只，雌雄不限，體重200～250 g。

1.2變應(yīng)性鼻炎模型制備及分組 選取6只大鼠作為空白對(duì)照組(未添加任何處理)，其余24只大鼠均給予OVA經(jīng)全身致敏，空白組每日腹腔注射等量生理鹽水，模型組以0.5 mg OVA溶于 1 ml 生理鹽水中，并于大鼠背部皮下10處注射，OVA經(jīng)全身強(qiáng)化致敏后第 7 天起每天一次用 1 mg/ml OVA 滴鼻(含有 OVA 溶液均以生理鹽水配制)，每次 20 μl，每日1次，共10次[6]。模型建立成功標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)鼻癢程度評(píng)定：輕擦鼻多次為1分；頻繁重度的抓搔面、鼻為2分。根據(jù)清涕流至位置評(píng)定：流至前鼻孔處為1分，流至超過(guò)前鼻孔處為2分，流至滿面時(shí)為3分。根據(jù)噴嚏的個(gè)數(shù)評(píng)定：10 min內(nèi)1～3個(gè)為1分，4～10個(gè)為2分，>11個(gè)為3分。以上3種評(píng)定方式疊加量化評(píng)分>5分即為造模成功。模型制備成功大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、香菊片低劑量組(鼻飼香菊片50 mg/kg)和香菊片高劑量組(鼻飼香菊片200 mg/kg)，每組6只。

1.3干預(yù)方法 空白對(duì)照組和模型組均以等體積的蒸餾水代替藥物；陽(yáng)性對(duì)照組采用氯雷他定(西安楊森制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20070030) 85 mg/kg灌胃給藥；香菊片低劑量組給予鼻飼香菊片50 mg/kg；香菊片高劑量組給予鼻飼香菊片200 mg/kg。5組均在10% OVA生理鹽水滴鼻之前30 min給藥，每天1次，共10次。

1.4HE染色觀察鼻黏膜病理形態(tài) 4周后，用水合氯醛麻醉小鼠，打開(kāi)鼻腔輕取鼻腔黏膜，去除周圍結(jié)締組織和血管分支，用肝素抗凝生理鹽水沖洗殘留血液，固定于 4%多聚甲醛溶液中24 h，將組織脫水浸蠟，包埋，切片，厚度4～5 μm，42℃純水中展片，粘附載玻片撈片，烤片機(jī)62℃烘片1 h，72℃烤箱烤片2 h后，行HE染色，染色后，乙醇脫水，二甲苯透明處理，切片滴上樹(shù)膠，蓋玻片封固。待樹(shù)膠干后，在光學(xué)電子顯微鏡下觀察大鼠鼻腔鼻黏膜病理形態(tài)的改變及嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。

1.5細(xì)胞因子水平檢測(cè) 取5組大鼠血清用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清IgE、IL-4、IL-8水平。

1.6掃描電鏡觀察鼻黏膜形態(tài) 4周后，用水合氯醛麻醉小鼠，打開(kāi)鼻腔后，輕取鼻腔黏膜，去除周圍的結(jié)締組織和血管分支，用肝素抗凝的生理鹽水沖洗去殘留血液，固定于4%多聚甲醛溶液中24 h，觀察鼻黏膜形態(tài)，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗雙側(cè)鼻腔黏膜后，固定于2.5%戊二醛溶液中，封口避光保存，固定24 h后，用掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1鼻黏膜病理形態(tài)和嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)情況 正常組鼻黏膜血管數(shù)量少，黏膜下致密纖維結(jié)締組織較薄，無(wú)血管改變和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組鼻黏膜小血管明顯增生擴(kuò)張，且鼻黏膜增厚，上皮下大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體擴(kuò)張，上皮分泌細(xì)胞增多，黏膜下腺體數(shù)量明顯增加，小血管無(wú)明顯擴(kuò)張；香菊片低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯降低；香菊片高劑量組鼻黏膜厚度與陽(yáng)性對(duì)照組比較無(wú)明顯降低，而炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕，小血管、腺體數(shù)量也減少。見(jiàn)圖1。

圖1 5大鼠鼻黏膜組織病理形態(tài)(HE×100) A.空白對(duì)照組；B.模型組；C.香菊片低劑量組；D.香菊片高劑量組；E.陽(yáng)性對(duì)照組

2.2血清IgE、IL-4、IL-8水平 模型組血清IgE、IL-4、IL-8水平明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)；陽(yáng)性對(duì)照組、香菊片低和高劑量組血清IgE、IL-4、IL-8水平均較模型組降低，且陽(yáng)性對(duì)照組低于香菊片低和高劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 5組治療前后血清免疫球蛋白E、白介素-4、白介素-8水平比較

注：空白對(duì)照組為正常大鼠，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、香菊片低、高劑量組均為變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型，陽(yáng)性對(duì)照組給予氯雷他定鼻飼，香菊片低、高劑量組鼻飼劑量分別為50、200 mg/kg；與空白對(duì)照組比較，bP<0.01；與模型組比較，aP<0.05，dP<0.01;與香菊片低劑量組比較，cP<0.05；與香菊片高劑量組比較，eP<0.05

2.3鼻腔纖毛變化 空白對(duì)照組鼻黏膜纖毛長(zhǎng)度及直徑一致，纖毛整齊，密集，擺動(dòng)規(guī)律，微管結(jié)構(gòu)規(guī)則；模型組鼻黏膜呈大片狀，大量黏附于纖毛頂端，且密度較大，陽(yáng)性對(duì)照組纖毛密集，局部略雜亂，微管結(jié)構(gòu)清晰；香菊片低劑量組纖毛密集，較整齊，偶見(jiàn)局部少量纖毛略雜亂；香菊片高劑量組纖毛之間無(wú)粘連，微管結(jié)構(gòu)清晰。見(jiàn)圖2。

圖2 5組大鼠鼻腔纖毛超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察(×100) A.空白對(duì)照組；B.模型組；C.香菊片低劑量組；D.香菊片高劑量組；E.陽(yáng)性對(duì)照組

3 討論

香菊片由化香樹(shù)果序、防風(fēng)、夏枯草、野菊花、辛夷、白芷、黃芪、甘草等中藥組成[7-8]，其中香樹(shù)果序具有宣通鼻竅，疏風(fēng)散邪的功效；防風(fēng)、夏枯草、野菊花具有清熱解毒，祛風(fēng)消腫功效；黃芪補(bǔ)脾益腎、祛風(fēng)解表，增強(qiáng)免疫力；辛夷具有抗組胺及收縮鼻黏膜血管的作用，能有效緩解變應(yīng)性鼻炎鼻癢、噴嚏、流涕癥狀；甘草調(diào)和諸藥，且現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，上述中藥配方中，含有大量黃酮及其他活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)免疫、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功效[9-14]。

變應(yīng)性鼻炎是由IgE所介導(dǎo)的過(guò)敏性疾病[15]。在變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病過(guò)程中，會(huì)有嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、T細(xì)胞的活化和肥大細(xì)胞的聚集等作用的發(fā)生[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞在過(guò)敏反應(yīng)的早期階段發(fā)揮著非常重要的作用[17]。當(dāng)特異性個(gè)體與過(guò)敏原接觸后，肥大細(xì)胞表面相關(guān)的受體FcεRI將會(huì)與IgE介導(dǎo)的過(guò)敏原結(jié)合，誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放組胺、炎性細(xì)胞因子、白三烯等，這些炎性介質(zhì)誘導(dǎo)鼻黏膜病理形態(tài)的改變，進(jìn)而出現(xiàn)鼻癢、流鼻涕、打噴嚏等癥狀[18-21]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-8在IgE的生成過(guò)程中有著重要的促進(jìn)作用[22]。本研究結(jié)果顯示，香菊片低和高劑量組血清IgE、IL-4、IL-8水平均較模型組降低，提示香菊片能夠通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子的水平來(lái)改善變應(yīng)性鼻炎的癥狀。

在鼻腔中，鼻黏膜纖毛是其非特異性免疫保護(hù)的重要結(jié)構(gòu)，纖毛微管蛋白臂滑動(dòng)有助于黏膜表面黏液的清除。纖毛受損會(huì)嚴(yán)重影響纖毛清除功能[23]。本研究結(jié)果顯示，香菊片可使纖毛密集整齊，纖毛之間無(wú)粘連，微管結(jié)構(gòu)清晰，提示香菊片能有效促進(jìn)纖毛增生，修復(fù)損傷的鼻黏膜，緩解鼻黏膜病理學(xué)改變，從而減輕變應(yīng)性鼻炎流涕及噴嚏等癥狀。

綜上所述，香菊片對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜形態(tài)及功能的具體作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子的水平、降低特異性IgE水平，從而改善變應(yīng)性鼻炎的癥狀。香菊片相關(guān)的調(diào)控信號(hào)途徑等仍需進(jìn)一步研究，以期發(fā)揮祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥之優(yōu)勢(shì)，挖掘出不良反應(yīng)小、效果佳的治療變應(yīng)性鼻炎中藥制劑。

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