何 標，廉 果

0 引言

槲皮黃酮(Quercetin,Qu)屬于黃酮類化合物，主要提取于裸子植物、蕨類植物及被子植物這三大類植物的根莖部位[1]。近年來研究報道，槲皮黃酮在臨床上的應用較為廣泛，因其抗氧化和抗炎癥反應的效果頗為顯著，還可用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥、糖尿病引起的多種并發(fā)癥及肥胖癥等[2-4]。在上述疾病中，槲皮黃酮在腫瘤治療中的研究最為深入。槲皮黃酮能夠抑制多種致癌劑及促癌劑的生物活性，而且在乳腺癌、肺癌、結腸癌及前列腺癌的治療中效果較好[5]。已有較多文獻報道槲皮黃酮具有抗細胞凋亡作用，對內皮細胞具有保護作用[6-7]。內皮細胞損傷在心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，可進一步導致高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病及阿爾茨海默病等疾病的發(fā)生[8]。

急性缺血性卒中是因為腦動脈閉塞引起的腦組織梗死，伴隨著神經(jīng)元細胞凋亡的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，轉化生長因子β-激活激酶1(TAK1)可介導下游多種生物學效應，包括炎癥、細胞凋亡、氧化應激損傷及細胞侵襲等，其上游的銜接蛋白腫瘤壞死因子相關受體因子6(Traf6)在TAK1的活化調節(jié)中起著重要的作用[9]。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，槲皮黃酮可通過抑制Traf6/IKKβ/NF-κB信號通路活性降低炎癥反應，從而對急性缺血性卒中大鼠具有較好的保護作用[10]。為了進一步研究槲皮黃酮的保護機制，本文在體外以氧糖剝奪方法構建原代皮層神經(jīng)元細胞的局部缺血/再灌注損傷，以進一步探討槲皮黃酮對神經(jīng)元細胞的保護作用。

1 材料及方法

1.1 材料 動物(SPF級ICR胎鼠，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供)；原代皮層神經(jīng)元細胞(本實驗室分離、培養(yǎng))；槲皮黃酮(Sigma,CAS No.117-39-5，≥99%)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(巴菲爾生物技術有限公司，批號：131221)；CCK8試劑盒(深圳保安康生物科技有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海谷歌生物有限公司，批號：P0010S-01)；Traf6質粒及陰性對照序列由武漢巴菲爾生物有限公司設計和合成；脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)；Neurobasal培養(yǎng)液；DMEM高糖培養(yǎng)基；神經(jīng)生長因子B27(50×)；200 mmol/L L-谷氨酰胺(100×)；胎牛血清(Gibco公司)；D-HANKS緩沖液；D-PBS緩沖液(Hyclone)；β-actin、TRAF6、p-TAK1、TAK1、Bax及Bcl-2一抗均購自美國Cell Signaling Technology；二抗羊抗兔IgG購自武漢谷歌生物有限公司。

1.2 儀器及器械 常規(guī)手術器械一套(高壓滅菌)；DNM-9602G型酶標儀(北京普朗新技術有限公司)；單人超凈臺(蘇州華新空調凈化有限公司)；細胞培養(yǎng)箱(上海醫(yī)用分析儀器廠)；凝膠電泳儀(北京六一儀器廠)；雙色紅外激光成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國)。

1.3 原代皮層神經(jīng)元細胞分離、培養(yǎng) 斷頸處死13.5 d懷孕的ICR小鼠，在超凈工作臺上取出胚胎，在冰上操作，取出腦部組織，分離出大腦皮層。將皮層組織轉移至冷的解剖液中，剪成小塊，再漂洗3次，加入室溫的胰蛋白酶進行消化，每間隔2 min輕輕振搖1次，加入含10% FBS的高糖培養(yǎng)基終止消化；用吸管反復輕輕吹打至組織塊消失，制備得到細胞懸液；4 ℃、1 000 r/min離心10 min后，棄去上清保存沉淀。細胞沉淀用神經(jīng)元細胞培養(yǎng)基重懸、計數(shù)，取適量濃度細胞接種至PLL包被過的6孔板中，每孔終體積2 mL，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次。

1.4 缺血/再灌注細胞模型(I/R)的構建[11]采用氧糖剝奪實驗進行構建，細胞培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞培養(yǎng)基被無血清、無葡萄糖的洛克緩沖液(154 mmol/L NaCl，5.6 mmol/L KCl，2.3 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，3.6 mmol/L NaHCO3，5 mmol/L HEPES，5 mg/mL慶大霉素，pH 7.2)代替，然后置于缺氧的培養(yǎng)箱(5% CO2，90%N2)中培養(yǎng)60 min，然后再轉移至正常環(huán)境條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 細胞相對存活率檢測 將對數(shù)生長期的皮層神經(jīng)元細胞進行消化、重懸、計數(shù)后，取適量細胞接種于96孔板中，每孔終體積為200 μL，每組設置6個復孔。待細胞貼壁生長至80%左右時，將細胞按“1.4”項操作處理60 min，棄去舊培養(yǎng)基，加入含不同濃度槲皮黃酮(10、20、40 μg/mL)的高糖培養(yǎng)基，置于正常環(huán)境中繼續(xù)孵育24 h。棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK8試劑，重新放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，置于酶標儀中于450 nm波長處檢測吸光度(OD)值，并計算細胞相對存活率。

1.6 細胞轉染 將神經(jīng)元細胞消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板，采用含10%胎牛血清無抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，當細胞貼壁生長至60%左右時開始轉染，轉染前4～6 h將要轉染的培養(yǎng)基換成無血清無抗生素的培養(yǎng)基。轉染步驟嚴格按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行，轉染48 h后倒置顯微鏡下觀察轉染效率，以期進行后續(xù)實驗。

1.7 免疫印跡檢測蛋白表達 將對數(shù)生長期的皮層神經(jīng)元細胞進行消化、重懸、計數(shù)后，取適量細胞接種于6孔板中，每孔終體積為2 mL，每組設置3個復孔。待細胞貼壁生長至80%左右時，將細胞按“1.4”項操作處理60 min，棄去舊培養(yǎng)基，加入含不同濃度槲皮黃酮的高糖培養(yǎng)基，置于正常環(huán)境中繼續(xù)孵育24 h。收集細胞裂解液，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，每孔上樣30 μg蛋白質進行凝膠電泳，電泳完成后將蛋白轉移至NC膜，然后一抗孵育過夜，洗膜3次后二抗孵育1 h，利用Odyssey近紅外掃描儀對β-actin、TRAF6、p-TAK1和TAK1表達水平進行檢測。

2 結果

2.1 槲皮黃酮對神經(jīng)元細胞增殖的影響 采用CCK8試劑對原代皮層神經(jīng)元細胞的增殖情況進行檢測，結果如圖1a所示，I/R組神經(jīng)元細胞經(jīng)過氧糖剝奪處理后，細胞的相對存活率較正常對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而經(jīng)過低、中、高劑量槲皮黃酮處理后，神經(jīng)元細胞的相對存活率顯著高于I/R細胞組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨著藥物濃度的增加，相對存活率升高越明顯，表現(xiàn)出濃度依賴性。同時，采用中劑量槲皮黃酮處理0、12、24、48、72 h，發(fā)現(xiàn)藥物作用時間越長，細胞相對存活率越高，結果見圖1b。

圖1 槲皮黃酮對神經(jīng)元細胞增殖的影響(n=6)

2.2 槲皮黃酮對凋亡蛋白表達的影響 采用Western blot檢測原代皮層神經(jīng)元細胞中凋亡蛋白表達情況，結果如圖2所示，I/R組神經(jīng)元細胞經(jīng)過氧糖剝奪處理后，促凋亡蛋白Bax顯著高于正常對照組，而抗凋亡蛋白Bcl-2明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。經(jīng)低、中、高劑量槲皮黃酮處理后，Bax表達水平顯著低于I/R細胞組，而Bcl-2顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且表現(xiàn)出濃度依賴性。

2.3 槲皮黃酮對Traf6/TAK1信號通路蛋白表達的影響 采用Western blot檢測神經(jīng)元細胞中Traf6/TAK1信號通路蛋白表達水平，結果如圖3所示，I/R組神經(jīng)元細胞經(jīng)過氧糖剝奪處理后，Ttaf6及p-TAK1表達水平顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低、中、高劑量槲皮黃酮處理后，Ttaf6及p-TAK1表達水平顯著低于I/R細胞組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且隨著藥物濃度的增加，Ttaf6及p-TAK1表達水平降低越明顯，表現(xiàn)出濃度依賴性。

圖2 槲皮黃酮對凋亡蛋白表達水平的影響(n=3)

圖3 槲皮黃酮對Traf6/TAK1信號通路蛋白表達水平的影響(n=3)

2.4 Traf6過表達對原代神經(jīng)元細胞凋亡的影響 將Traf6質粒及陰性對照質粒瞬時轉染神經(jīng)元細胞48 h后，對凋亡蛋白的檢測結果如圖4所示。結果表明Traf6蛋白在細胞過表達可誘導促凋亡蛋白Bax表達、抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達，說明Traf6在細胞中的過表達可激活凋亡通路，引起細胞凋亡的發(fā)生。

圖4 Traf6過表達對凋亡蛋白表達的影響(n=3)

2.5 槲皮黃酮通路Traf6降低神經(jīng)元細胞的凋亡 將Traf6質粒和陰性質粒轉染神經(jīng)元細胞48 h后，用20 μg/mL槲皮黃酮處理轉染細胞24 h后，采用Western blot檢測細胞中Traf6、TAK1、p-TAK1、Bax及Bcl-2蛋白表達水平，結果如圖5所示。結果表明，轉染了Traf6質粒的細胞中，Traf6蛋白表達水平顯著高于正常對照組，并且p-TAK1、Bax表達水平均顯著高于正常對照組，Bcl-2則低于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。經(jīng)20 μg/mL槲皮黃酮處理24 h后，Traf6、p-TAK1、Bax表達水平顯著低于Traf6過表達組，Bcl-2則顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明槲皮黃酮可以通過抑制Traf6的表達，進而抑制細胞凋亡通路的活化，減少細胞凋亡的發(fā)生。

3 討論

缺血性卒中在腦血管疾病中的致死率、致殘率位居第2位，盡管在卒中發(fā)作開始就接受了良好的治療，但也有將近40%的患者死亡或者留下后遺癥[10]。缺血性卒中的發(fā)作是由多種病理生理學過程和復雜的分子機制引起的，其中神經(jīng)元細胞凋亡的發(fā)生始終存在于缺血性卒中發(fā)作的全過程。前期的動物實驗發(fā)現(xiàn)，槲皮黃酮對急性缺血性卒中大鼠起保護作用，并且可以通過抑制Traf6/IKKβ/NF-κB炎癥信號通路的活化來達到治療效果[11]。Traf6是胞漿中的一種銜接蛋白，可以傳導胞膜上多種受體介導的信號刺激，進而使細胞產(chǎn)生相應的生物學效應。Gong等[12]研究表明，Traf6在大鼠中的過表達，可以增加急性缺血性卒中大鼠腦組織的死亡面積，加劇皮層神經(jīng)元細胞的凋亡率。由此說明，Traf6介導的下游信號通路，包括炎癥、細胞凋亡及氧化應激相關的通路均與缺血/再灌注損傷相關。

圖5 槲皮黃酮通過Traf6降低神經(jīng)元細胞凋亡(n=3)

為了進一步探究槲皮黃酮對缺血卒中的保護作用機制，本研究采用糖氧剝奪誘導神經(jīng)元細胞缺血/再灌注模型，發(fā)現(xiàn)糖氧剝奪誘導組細胞凋亡蛋白表達水平與正常對照組差異有統(tǒng)計學意義，說明缺血/再灌注細胞模型構建成功。低、中、高劑量槲皮黃酮處理模型組細胞后，結果發(fā)現(xiàn)，槲皮黃酮可以明顯降低細胞中促凋亡蛋白Bax表達，促進抗凋亡蛋白Bcl-2表達，抑制Traf6/TAK1信號通路的活化，并且均表現(xiàn)出濃度依賴性。為了進一步探究槲皮黃酮是否通過Traf6來調控細胞凋亡發(fā)生，本研究構建了過表達Traf6的細胞，采用槲皮黃酮處理后Traf6、p-TAK1、Bax的表達水平明顯降低，Bcl-2的表達明顯升高。表明槲皮黃酮是通過抑制Traf6的表達來調控神經(jīng)元細胞的凋亡情況。

綜上所述，槲皮黃酮對皮層神經(jīng)元細胞凋亡發(fā)生表現(xiàn)出抑制作用，其可能作用機制與抑制Traf6/TAK1信號通路有關。

[1] 馬云峰,尚富德.黃酮類化合物在藥用植物中的分布[J].生物學雜志,2003,20(1):35-39.

[2] Comalada M,Camuesco D,Sierra S,et al.In vivo quercitrin anti-inflammatory effect involves release of quercetin,which inhibits inflammation through down-regulation of the NF-kappaB pathway[J].Eur J Immunol,2005,35(2):584-592.

[3] Dok-Go H,Lee KH,Kim HJ,et al.Neuroprotective effects of antioxidative flavonoids,quercetin,(+)-dihydroquercetin and quercetin 3-methyl ether,isolated from Opuntia ficus-indica var.saboten[J].Brain Res,2003,965(1-2):130-136.

[4] Lu J,Papp LV,Fang J,et al.Inhibition of mammalian thioredoxin reductase by some flavonoids:implications for myricetin and quercetin anticancer activity[J].Cancer Res,2006,66(8):4410-4418.

[5] Dallavalle S,Ferrari A,Biasotti B,et al.Novel 7-oxyiminomethyl derivatives of camptothecin with potent in vitro and in vivo antitumor activity[J].J Med Chem,2001,44(20):3264-3274.

[6] Wang YK,Huang ZQ.Protective effects of icariin on human umbilical vein endothelial cell injury induced by H2O2 in vitro[J].Pharmacol Res,2005,52(2):174-182.

[7] Wang YK,Hong YJ,Wei M,et al.Curculigoside attenuates human umbilical vein endothelial cell injury induced by H2O2[J].J Ethnopharmacol,2010,132(1):233-239.

[8] Foster MW,Hess DT,Stamler JS.Protein S-nitrosylation in health and disease:a current perspective[J].Trends Mol Med,2009,15(9):391-404.

[9] Landstr?m M.The TAK1-TRAF6 signalling pathway[J].Int J Biochem Cell Biol,2010,42(5):585-589.

[10]Gong J,Li ZZ,Guo S,et al.Neuron-specific tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 Is a central regulator of neuronal death in acute ischemic stroke[J].Hypertension,2015,66(3):604-616.

[11]Deaton C,Froelicher ES,Wu LH,et al.The global burden of cardiovascular disease[J].J Cardiovasc Nurs,2011,26(4 Suppl):S5-S14.

[12]何標,廉果.槲皮黃酮對急性缺血性卒中大鼠的保護作用及機制[J].廣東藥學院學報,2017,33(3):371-374.