吳 斌，房杰群，溫似春

1深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科，廣東 深圳 518106；2深圳市人民醫(yī)院泌尿外科，廣東 深圳 518020；3廣東省人民醫(yī)院協(xié)和病區(qū)，廣東 廣州 510080

膀胱癌為泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013年美國(guó)約有72 500例新診斷的膀胱癌和17 960例膀胱癌死亡病例[2]。膀胱癌有很多病理類型，尿路上皮癌占膀胱癌的90%左右[3]。膀胱癌細(xì)胞的復(fù)雜表型由功能性反應(yīng)基因控制。MicroRNA主要是抑制基因表達(dá)的小型非編碼RNA，它們?cè)诎┌Y中增加或減少，能夠促進(jìn)或抑制癌癥發(fā)展[4]。有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-429在癌癥中表達(dá)增加，如子宮內(nèi)膜癌和結(jié)腸直腸癌[5-6]。但有研究表明，miR-429在骨肉瘤，腎細(xì)胞癌和宮頸癌中起著抑制腫瘤作用[7-8]。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)miR-429在膀胱癌中的表達(dá)是增加的[9]。miR-429屬于miR-200家族，也有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR200家族在膀胱癌中的表達(dá)上調(diào)，高microRNA-200C表達(dá)與膀胱肌肉浸潤(rùn)性尿路上皮癌中疾病死亡的風(fēng)險(xiǎn)之間應(yīng)該存在正相關(guān)關(guān)系[10]。本文為探究miR-429在膀胱癌中的表達(dá)及作用機(jī)制做了如下研究：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇廣東省內(nèi)3家醫(yī)院2014年1月～2016年12月期間收集的膀胱癌標(biāo)本120例，同時(shí)選取距離腫瘤邊緣大于2 cm的癌旁組織作為對(duì)照。所有患者已經(jīng)病理科明確診斷。具體情況見(jiàn)表1。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重電解質(zhì)紊亂者；嚴(yán)重肝腎功能不全、心功能不全、嚴(yán)重感染者；神志不清，無(wú)法配合著。所有受試者已獲得知情同意，并已通過(guò)我院倫理會(huì)的批準(zhǔn)。

表1 膀胱癌一般情況分布表（n=120）

1.2 研究方法

1.2.1 組織標(biāo)本的收集 收集手術(shù)過(guò)程中經(jīng)病理確診的膀胱癌組織，和距離腫瘤邊緣大于2 cm（鏡下未見(jiàn)癌細(xì)胞）的癌旁組織，大小0.5 cm×0.5 cm，將組織置于裝入凍存管，置于液氮罐中保存。

1.2.2 RNA的提取和miR-429的QRT-PCR測(cè)定 采用Trizol（Invitrogen，Life Technologies）法從組織內(nèi)提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA（PrimeScript RT Reagent Kit，Takara）。用 QRT-PCR法（SYBR Premix Ex Taq Kit，Takara ，7500 real-time PCR system ，Applied Biosystems）測(cè)定血清miR-429的表達(dá)，用用U6 miRNA作為內(nèi)參。

miR-429 擴(kuò) 增 引 物 ：F ：5 ′-GGAATGCGCGA GGAGAACAA-3 ′，R:5 ′-CATCATCATGACCTG GATCGC-3，U6 miRNA擴(kuò)增引物：F：5′-ATTGGAA CGATACAGAGAAGATT-3 ′，R: 5 ′-GGAACGCT TCACGAATTTG-3′。使用公式2–ΔΔCt計(jì)算miR-21相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 用含有10%的胎牛血清，1%鏈霉素-青霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)T24細(xì)胞系（膀胱癌細(xì)胞系）。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況每1～3 d更換1次培養(yǎng)基。

1.2.4 RNA干擾實(shí)驗(yàn) 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)（廣州瑞博siRNA使用說(shuō)明（2009-08））進(jìn)行操作。設(shè)置miR-429過(guò)表達(dá)模型（miR-429 mimic），空白對(duì)照（miR-429 mimic control）；miR-429敲除模型（siRNA），空白對(duì)照（siRNA control）。分別觀察miR-429過(guò)表達(dá)或者敲除時(shí)T24細(xì)胞增殖和凋亡情況。

1.2.5 細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 采用MTT比色法判斷細(xì)胞增殖情況；采用Caspase 3 ELISA試劑盒（R&D，Minneapolis，MN，USA）判斷細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19. 0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料比較用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 miR-429的相對(duì)表達(dá)量

膀胱癌組織miR-429的相對(duì)表達(dá)水平高于正常膀胱組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 miR-429在膀胱癌組織組織和癌旁組織的表達(dá)

2.2 miR-429的表達(dá)水平與膀胱癌臨床相關(guān)參數(shù)的關(guān)系

由表2可知，miR-429的表達(dá)水平與膀胱癌的腫瘤大小、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，以及TNM分期有關(guān)（P＜0.05）；腫瘤直徑大于5 cm組miR-429的表達(dá)水平高于腫瘤直徑小于5 cm組；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌組miR-429的表達(dá)水平高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌組；Ⅲ+Ⅳ期膀胱癌組miR-429的表達(dá)水平高于Ⅰ+Ⅱ期膀胱癌，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。miR-429的表達(dá)水平與膀胱癌患者的年齡、性別無(wú)關(guān)（P＞0.05）。

2.3 miR-429過(guò)表達(dá)或者敲除時(shí)T24細(xì)胞增殖和凋亡情況

miR-429過(guò)表達(dá)時(shí)，膀胱癌細(xì)胞（T24細(xì)胞系）增殖增加，凋亡減少；而miR-429敲除時(shí)，膀胱癌細(xì)胞（T24細(xì)胞系）增殖減少，凋亡增加（圖2）。

表2 miR-429的表達(dá)水平與膀胱癌臨床相關(guān)參數(shù)的關(guān)系

3 討論

統(tǒng)計(jì)顯示全球有270萬(wàn)人患有膀胱癌[11]。 在發(fā)展中國(guó)家，人口老齡化和煙草使用量高使得膀胱癌的發(fā)病率顯著高于發(fā)達(dá)國(guó)家[12]。大約25%的新診斷的膀胱癌患者存在肌肉侵襲，需要根治性手術(shù)或放射治療[13]。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，涉及到多種細(xì)胞因子、蛋白、生長(zhǎng)分化因子的參與。近年來(lái)，關(guān)于miRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系逐漸成為研究熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[14]。miRNAs參與人類30%～60%基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[15]。由于1個(gè)miRNA可作用于上百個(gè)不同的基因，因此miRNA的功能失調(diào)，可導(dǎo)致正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，超過(guò)一半的miRNAs基因位于腫瘤相關(guān)基因組區(qū)或脆性位點(diǎn)[16]。提示miRNAs在人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

圖2 miR-429過(guò)表達(dá)或者敲除時(shí)T24細(xì)胞增殖和凋亡情況

本研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織miR-429的相對(duì)表達(dá)水平高于正常膀胱組織（P＜0.05），這與Yang等[17]研究結(jié)果相一致，提示miR-429可能在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。進(jìn)一步相關(guān)分析顯示，miR-429的表達(dá)水平與膀胱癌的腫瘤大小、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（P＜0.05）。有研究對(duì)165例神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞患者進(jìn)行追蹤隨訪，也發(fā)現(xiàn)miR-429高表達(dá)的患者，其腫瘤較早發(fā)生轉(zhuǎn)移[18]，這也與本研究結(jié)果相類似。但也有研究認(rèn)為miR-429可以抑制星細(xì)胞瘤的增殖，可能miR-429在不同類型的腫瘤中具有不同的作用機(jī)制[19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)miR-429可以促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖，抑制凋亡。miR-429在膀胱癌中的可能作用機(jī)制：細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B（CDKN2B）是一種腫瘤抑制因子，CDKN2B 3′UTR具有miR-429的結(jié)合位點(diǎn)，miR-429可以與CDKN2B結(jié)合[20]。miR-429表達(dá)增加，可以抑制CDKN2B的表達(dá)，從而促進(jìn)促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖，抑制凋亡。miR-429還可以調(diào)控PTEN、RASSF8和TIMP2等抑癌基因以促進(jìn)腫瘤發(fā)生[21]。

綜上所述，miR-429在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，其表達(dá)水平對(duì)膀胱癌的嚴(yán)重程度及預(yù)后情況具有一定的參考價(jià)值。

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