柯莉娜,鄭 靜,張瑞娟,王 勤,石 艷

(廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建廈門361102)

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1,tyrosinase)又稱為多酚氧化酶,是一種含銅的金屬酶,廣泛存在于微生物、動(dòng)植物和人體中[1]．它具有單酚酶活性和二酚酶活性,能將酪氨酸羥化,產(chǎn)生鄰位二羥基苯丙氨酸(L-DOPA),然后再將L-DOPA氧化成多巴醌,進(jìn)一步生成一系列引起褐化的色素類物質(zhì)[2]．已有研究發(fā)現(xiàn)黑色素的生物合成由3種黑色素細(xì)胞特異酶催化:酪氨酸酶蛋白(TYR)、酪氨酸酶家族相關(guān)蛋白(TRP-1和TRP-2)[3-4]．酪氨酸酶的異常表達(dá)可直接或間接導(dǎo)致人類疾病,如惡性黑色素瘤、皮膚斑點(diǎn)[5]和白癜風(fēng)．黑色素對(duì)于人體的皮膚保護(hù)和內(nèi)環(huán)境平衡是不可或缺的，適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)黑色素對(duì)皮膚的健康非常重要[6]．近期的研究表明,白癜風(fēng)患者的腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)存在缺陷[7],需通過皮下注射來進(jìn)行臨床治療．目前用于治療白癜風(fēng)的藥物,絕大部分是從中草藥中提取出有效成分制成的中成藥,例如類黃酮、芹黃素和淫羊藿[8]等,通過化學(xué)合成得到的相關(guān)藥物很少．

咖啡酸又稱為3,4-二羥基肉桂酸,是一種天然存在的酚酸,屬于多羥基苯乙烯酸類化合物,廣泛存在于林產(chǎn)植物中,如山楂、沙棘和升麻等．最近,一些研究表明咖啡酸及其衍生物具有多種生物活性,包括抗腫瘤、抗炎、抗氧化[9]等．特別是咖啡酸酯類衍生物,如咖啡酸苯乙酯已經(jīng)引起了相當(dāng)大的關(guān)注[10]．根據(jù)本課題組之前的研究,咖啡酸對(duì)蘑菇酪氨酸酶的單酚酶和二酚酶具有激活作用[11]．本研究合成了2種新型咖啡酸嗎啉胺衍生物咖啡酸-2-氨乙基嗎啉胺(C-1)和咖啡酸-N-氨丙基嗎啉胺(C-2),并通過質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)以及紅外光譜(IR)技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu),進(jìn)而研究了C-1和C-2對(duì)蘑菇酪氨酸酶的激活效果和機(jī)制以及對(duì)黑色素合成代謝途徑的影響,以期為治療酪氨酸酶低表達(dá)引起的相關(guān)疾病提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材 料

蘑菇酪氨酸酶(后簡(jiǎn)稱酪氨酸酶)購于Sigma公司(St. Louis,MO,USA),酶活力為6 680 U/mg;1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、L-DOPA購于Aldrich 公司(St. Louis,MO,USA);咖啡酸購于TCI公司(上海,中國(guó));2-氨乙基嗎啉、N-氨丙基嗎啉、N-甲基嗎啉購于Sigma 公司(St.Louis,MO,USA);TYR抗體和α-促黑色素激素(α-MSH)抗體購于Abcom 公司(Cambridge,England);TRP-1抗體和內(nèi)參蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購于Proteintech公司 (Chicago,USA);TRP-2抗體購于Thermo Scientific公司(Waltham,MA,USA);羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG購于生工生物工程有限公司(上海,中國(guó));其他試劑均購于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純;使用的蒸餾水為去離子重蒸水．

1.2 儀 器

傅里葉IR儀(Nicolet iS5,Thermo Fisher公司);NMR儀(AVANCE-Ⅲ600 MHz,BRUKER公司);液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)儀(Waters 2767,Waters公司);熒光分光光度計(jì)(Cary Eclipse,Varian公司);多功能酶標(biāo)儀(M-450,BIO-RAD公司);核酸蛋白分析儀(DU-800,Beckman公司)．

1.3 方 法

1.3.1 樣品制備

咖啡酸嗎啉胺的制備方法如下:咖啡酸溶于二氯甲烷中,加入等濃度的2-氨乙基嗎啉或N-氨丙基嗎啉,以EDC·HCl作為脫水劑,DMAP作為催化劑,再加入N-甲基嗎啉作為標(biāo)準(zhǔn)堿,于油浴中加熱攪拌反應(yīng)6～7 h；反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑后得到黃色稠狀液體,再通過凝膠柱層析純化；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到黃色粉末,烘干,待用．

1.3.2 酪氨酸酶活力測(cè)定

按照文獻(xiàn)[11]的方法稍作修改:在磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 6.8)中,以L-DOPA 為底物測(cè)定酪氨酸酶的活力．先加入0.1 mL含不同濃度的化合物于比色杯中,再加入2.8 mL在30 ℃恒溫水浴中預(yù)熱的底物溶液(含PBS和L-DOPA),然后加入0.1 mL酪氨酸酶水溶液,立刻充分混勻,在30 ℃恒溫條件下檢測(cè)波長(zhǎng)475 nm處的吸光度隨時(shí)間的變化,從直線的斜率計(jì)算出酶的活力,產(chǎn)物的消光系數(shù)按3 700 L/(mol·cm)計(jì)算．

1.3.3 全波長(zhǎng)掃描

采用酪氨酸酶二酚酶的測(cè)活體系[11],在含有0.5 mmol/LL-DOPA、1.33 μg/mL酪氨酸酶、0.05 mol/L PBS(pH 6.8)的反應(yīng)體系中,采用DU-800型核酸蛋白分析儀,在200～800 nm光譜范圍內(nèi)，實(shí)時(shí)跟蹤不同濃度的樣品(C-1和C-2)作用下酪氨酸酶催化產(chǎn)物在相同時(shí)間后的變化,以及相同濃度的樣品作用下酪氨酸酶催化產(chǎn)物在不同時(shí)間后的變化．

1.3.4 熒光猝滅

采用Cary Eclipse熒光光度計(jì)測(cè)試?yán)野彼崦竷?nèi)源熒光強(qiáng)度的變化,激發(fā)光波長(zhǎng)設(shè)定為280 nm,發(fā)射光夾縫寬度為10 nm,檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為300～450 nm．在2 mL酪氨酸酶的體系中加入不同濃度的激活劑后,對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行掃描．每個(gè)濃度重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)．

熒光分子與猝滅劑間的猝滅速率都遵循Stern-Volmer曲線方程[12]:

F0/F=1+Kqτ0c(Q)=1+Ksvc(Q).

式中：F0和F分別是猝滅前、后的熒光強(qiáng)度,Kq是雙分子的動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù),τ0是不存在猝滅劑時(shí)的熒光生命周期(10-8s),c(Q)是熒光猝滅劑濃度,Ksv是Stern-Volmer曲線的猝滅速率常數(shù)．根據(jù)Stern-Volmer曲線方程,以F0/F對(duì)所加入的化合物終濃度c(Q)作圖,得到化合物對(duì)酪氨酸酶熒光的Stern-Volmer曲線,依此判斷其熒光猝滅機(jī)制．

1.3.5 化合物對(duì)酪氨酸酶的分子對(duì)接模擬

采用MOE軟件(CCG公司)進(jìn)行蛋白質(zhì)-配體對(duì)接．在對(duì)接前,先將激活劑和酪氨酸酶的三維結(jié)構(gòu)能量最小化．分子對(duì)接的參數(shù)如下:Receptor和Site分別設(shè)置為Receptor Atoms和Dummy Atoms,Refinement設(shè)置為Forcefield;Retain的第一和第二得分都設(shè)置為10,第一次和第二次Rescoring都設(shè)置為L(zhǎng)ondon dG;MM/GBVI綁定自由能得分用于排名對(duì)接；其他參數(shù)使用軟件的默認(rèn)設(shè)置．在對(duì)接構(gòu)象的過程中,選擇得分最高的位點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接,再根據(jù)所選模式分析酶蛋白分子與化合物綁定后的對(duì)接結(jié)果．

1.3.6 細(xì)胞毒理試驗(yàn)

細(xì)胞毒理通過噻唑藍(lán)(MTT)試驗(yàn)測(cè)定[13]．人體正常肝細(xì)胞LO2培養(yǎng)至密度為5×103/孔后,添加不同濃度的化合物與其孵育24和48 h；然后在每孔中加入10 μL MTT溶液(用PBS配制,終質(zhì)量濃度5 mg/mL),在37 ℃孵育4 h,棄上清液；每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)并震蕩10 min,讓紫色甲瓚完全溶解；在570 nm下測(cè)定其吸光度．未加化合物處理時(shí)的吸光度作為細(xì)胞100%存活的標(biāo)準(zhǔn)．

1.3.7 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活力測(cè)定

人體黑色素瘤細(xì)胞M14內(nèi)酪氨酸酶活力的測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)[14]進(jìn)行部分改進(jìn)：收集細(xì)胞,1 500 r/min離心5 min后棄上清液,保留細(xì)胞沉淀；在細(xì)胞沉淀中加入0.01 mol/L含有1%(體積分?jǐn)?shù))吐溫-100的PBS,然后懸浮細(xì)胞冷凍于-80 ℃；取出完全凍結(jié)的細(xì)胞,在室溫下自然融化，反復(fù)凍融2次后,12 000 r/min 離心15 min得到的上層清液即為酪氨酸酶液；在96孔板的各孔中加入10 μL不同濃度的化合物和10 μL細(xì)胞酪氨酸酶液,然后加入180 μL PBS配制的0.1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))L-DOPA (pH 6.8)，在30 ℃下孵育30 min,于475 nm處測(cè)定其吸光度．

圖1 C-1和C-2的合成路徑與結(jié)構(gòu) Fig.1Synthetic processes and structures of compound C-1 and C-2

1.3.8 細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)量分析

采用不同質(zhì)量濃度(0,10,20,30,40 μg/mL)的化合物處理M14細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后,經(jīng)0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶消化,收集細(xì)胞；5 000 r/min離心取上清液,加入200 μL的RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液,冰上裂解1 h；10 000 r/min離心取上清液,測(cè)定蛋白濃度,分裝,加入4×上樣緩沖液,100 ℃熱變性30 min；所得樣品進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(恒定電壓90 V,110 min)后轉(zhuǎn)膜(恒定電流300 mA,1 h),在4 ℃下孵育一抗過夜,用含1%(體積分?jǐn)?shù))吐溫-20的Tris-鹽酸緩沖液洗滌3次后,室溫下孵育二抗1 h；再洗滌3次后顯影,分析相關(guān)蛋白的表達(dá)量．

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡酸嗎啉胺的合成路徑及結(jié)構(gòu)鑒定

咖啡酸嗎啉胺的合成路徑如圖1所示,純化后得到黃色粉末,進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,結(jié)果如下：

2.2 化合物對(duì)酪氨酸酶的激活作用

(a)C-1和C-2作用下的酪氨酸酶活力測(cè)定;(b)和(c)分別為C-1和C-2的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖,其中曲線0～4對(duì)應(yīng)的 C-1濃度依次為0,0.125,0.250,0.375,0.500 mmol/L,C-2濃度依次為0,0.025,0.050,0.075,0.100 mmol/L．圖2 咖啡酸衍生物對(duì)酪氨酸酶的激活作用以及激活類型 Fig.2Activation activity of caffeic acid derivatives on tyrosinase activity and determination of the activation type of tyrosinase

從圖2(a)可以看出,C-1和C-2對(duì)酪氨酸酶均具有明顯的激活作用，其半激活質(zhì)量濃度(EC50)分別為0.06和0.12 mmol/L，由此可見,C-1對(duì)酪氨酸酶的激活效果約為C-2的2倍．由圖2(b)和(c)可知,Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖均為相交于第二象限的一組直線，直線縱軸截距和直線斜率隨著化合物濃度增大而減小,因此可以判斷C-1和C-2對(duì)酪氨酸酶的激活類型均屬于混合型激活．

(a)～(c)分別為體系中未加化合物、加入0.05 mmol/L C-1和C-2在連續(xù)時(shí)間內(nèi)L-DOPA氧化產(chǎn)物的累積光譜圖,其中 曲線0表示化合物在該波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光譜,曲線1～11分別代表加入酪氨酸酶0～10 min后的光譜．(d)和(e)分別為不同濃度的 C-1和C-2在相同時(shí)間(10 min)內(nèi)L-DOPA氧化產(chǎn)物的累積光譜圖,其中曲線0～6對(duì)應(yīng)的C-1加入濃度依次為0,0.075, 0.150,0.225,0.300,0.375和0.450 mmol/L,C-2加入濃度依次為0,0.015,0.030,0.045,0.060,0.075和0.090 mmol/L．圖3 咖啡酸衍生物對(duì)酪氨酸酶催化氧化作用的全波長(zhǎng)掃描分析 Fig.3Full wavelength scanning analysis of caffeic acid derivatives on tyrosinase catalytic oxidation

圖3(a)是L-DOPA在未加化合物的情況下,酪氨酸酶催化氧化作用不同時(shí)間后的紫外-可見光譜,475 nm處特征峰的累積量為0.41．由圖3(b)和(c)可以看出,在體系中添加C-1和C-2,10 min后產(chǎn)物累積量分別增加了78%和58%．由圖3(d)和(e)可以看出,隨著C-1和C-2濃度的增加,475 nm處的吸收峰也在不斷地增加．該結(jié)果進(jìn)一步佐證了2種化合物對(duì)酪氨酸酶的激活作用．

2.3 化合物與酪氨酸酶的相互作用

從圖4(a)和(b)可以看出,酪氨酸酶的熒光強(qiáng)度隨著C-1和C-2濃度的增大而有規(guī)律地降低,且熒光發(fā)射波長(zhǎng)出現(xiàn)略微紅移．以F0/F對(duì)C-1和C-2終濃度c(Q)作圖,得到化合物對(duì)酪氨酸酶熒光強(qiáng)度的Stern-Volmer曲線,如圖4(c)和(d)所示．通過計(jì)算可知,C-1和C-2的熒光猝滅速率常數(shù)Ksv分別為7.06×10-6和1.31×10-5L/mol；其動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)Kq分別為706和13.1 L/(mol·s),均遠(yuǎn)小于各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大Kq值2.0×1010L/(mol·s),說明C-1和C-2對(duì)酪氨酸酶的熒光猝滅均屬于動(dòng)態(tài)猝滅機(jī)制．

(a)和(b)分別為C-1和C-2作用下酪氨酸酶的熒光譜圖，(a)中曲線0～10對(duì)應(yīng)的C-1加入濃度依次為0,0.01,0.02,0.03, 0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.10 μmol/L，(b)中曲線0～8對(duì)應(yīng)的C-2加入濃度依次為 0,0.02,0.04,0.06, 0.08,0.10,0.12,0.14,0.16 μmol/L;(c)和(d)分別為不同濃度的C-1和C-2對(duì)酪氨酸酶熒光強(qiáng)度的Stern-Volmer曲線．圖4 不同濃度的咖啡酸衍生物對(duì)酪氨酸酶熒光強(qiáng)度的影響 Fig.4Impacts on changes of tyrosinase fluorescence by different concentrations of caffeic acid derivatives

通過分子對(duì)接模擬進(jìn)一步探索了C-1、C-2與酪氨酸酶的對(duì)接模式以及酶催化部位，受體所暴露的差異性可通過與氨基酸殘基結(jié)合的強(qiáng)度顯示．從圖5的對(duì)接構(gòu)象可以看出,2種化合物均不能與酪氨酸酶的金屬銅離子相互作用,但可與活性中心的氨基酸殘基相互作用．如圖5(a)所示:C-1氨基上的自由氫可以與酪氨酸酶活性中心的Asn260殘基形成氫鍵,雜環(huán)供氧可以與Asn260和His244殘基形成氫鍵,這些結(jié)構(gòu)能夠改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象;此外,C-1還能與活性中心的Val248、Val283、His61、His85、His263、His259、Phe90、Phe264和Glu256殘基相互作用．如圖5(b)所示:C-2氨基上的自由氫可以與酪氨酸酶活性中心的Asn260殘基形成氫鍵,雜環(huán)供氧可以與His61殘基形成氫鍵,這些結(jié)構(gòu)能夠改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象;此外,C-2還能與活性中心的Val283、His94、His85、His263、His259、Phe264、Phe292、Phe90、Ala286、Arg268、Ser282、Thr84和Glu256殘基相互作用．

2.4 化合物對(duì)人正常肝細(xì)胞LO2的毒理試驗(yàn)

通過MTT法檢測(cè)化合物對(duì)人體正常肝細(xì)胞LO2的影響．如圖6所示,LO2細(xì)胞在經(jīng)過不同質(zhì)量濃度 (5,10,20,40,60,80,100,120 μg/mL)的C1和C2處理24 h后,處理組與對(duì)照組之間并無明顯差異,而處理48 h后對(duì)LO2細(xì)胞的存活有一定促進(jìn)作用,說明C-1和C-2無細(xì)胞毒性．

圖5 C-1(a)和C-2(b)與酪氨酸酶的氨基酸殘基之間的對(duì)接模型 Fig.5Binding modes of C-1(a) and C-2(b) with amino acid residues of tyrosinase

2.5 化合物對(duì)M14細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的激活作用

由圖7可以看出,在濃度為0,0.1,0.2,0.3,0.4和0.5 mmol/L 的C-1和C-2的作用下,M14細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活力增加,且激活作用呈現(xiàn)出濃度依賴性．相同濃度下,C-2對(duì)酪氨酸酶的激活效果比C-1好．

圖6 C-1(a)和C-2(b)對(duì)LO2細(xì)胞存活的影響 Fig.6Effects of C-1(a) and C-2(b) on LO2 cell viability

圖7 C-1和C-2對(duì)M14細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活力的影響 Fig.7Effects of C-1 and C-2 on intracellular tyrosinase activity of M14 cells

2.6 化合物對(duì)黑色素合成蛋白表達(dá)量的影響

通過蛋白免疫印跡法檢測(cè)化合物對(duì)M14細(xì)胞中黑色素合成相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響．由圖8可以看出,化合物C-1和C-2對(duì)TYR、TRP-1、TRP-2和α-MSH蛋白的表達(dá)量均起上調(diào)作用,而內(nèi)參GAPDH蛋白的表達(dá)量無明顯變化．

3 討 論

本研究中合成了2種新型的咖啡酸衍生物C-1和C-2,并分析發(fā)現(xiàn)其對(duì)酪氨酸酶具有較好的激活作用,激活類型均屬于混合型激活，其中C-1的激活效果更好,初步推測(cè)可能與碳鏈的長(zhǎng)短有關(guān)．

圖8 C-1(a)和C-2(b)對(duì)M14細(xì)胞內(nèi)TYR、TRP-1、 TRP-2和α-MSH蛋白表達(dá)量的影響 Fig.8Effects of C-1(a) and C-2(b) on TYR,TRP-1, TRP-2 and α-MSH expression levels in M14 cells

熒光猝滅法經(jīng)常被用來研究配體與蛋白質(zhì)之間的相互作用．本研究結(jié)果顯示酪氨酸酶的熒光強(qiáng)度隨著C-1和C-2濃度的增大而降低,然而酪氨酸酶的熒光發(fā)射光譜并沒有隨著C-1和C-2濃度的增大而發(fā)生明顯的轉(zhuǎn)變,由此可知化合物與酪氨酸酶之間的相互作用只影響與酪氨酸酶的熒光基團(tuán)緊密相連的微環(huán)境,而直接環(huán)境中的猝滅殘留物并沒有發(fā)生變化．C-1和C-2能夠使酪氨酸酶的最大熒光發(fā)射峰隨著濃度的增加而發(fā)生略微的紅移,對(duì)酪氨酸酶的熒光猝滅屬于動(dòng)態(tài)猝滅機(jī)制．此外,隨著C-1和C-2濃度的增加,其對(duì)應(yīng)的猝滅速率常數(shù)Ksv也增大．比較2種化合物的趨勢(shì)變化,酪氨酸酶與C-1之間呈現(xiàn)出更強(qiáng)的相互作用,而與C-2之間的相互作用較弱,這與酶活測(cè)定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致．

在分子對(duì)接的模擬中,C-1和C-2沒有直接綁定到酪氨酸酶活性中心的銅離子,而主要和酪氨酸酶的氨基酸殘基,如Asn260等形成氫鍵．這些結(jié)構(gòu)可能改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象,從而影響酪氨酸酶活力．

在細(xì)胞水平上研究發(fā)現(xiàn)C-1和C-2對(duì)人體正常肝細(xì)胞LO2沒有毒害作用;此外,C-1和C-2還能增強(qiáng)人體黑色素瘤細(xì)胞M14內(nèi)的酪氨酸酶活力．通過蛋白免疫印跡進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),C-1和C-2對(duì)M14細(xì)胞內(nèi)的TYR、TRP-1、TRP-2和α-MSH幾個(gè)黑色素合成相關(guān)蛋白的表達(dá)量均起上調(diào)作用．因此,化合物可有效地提高細(xì)胞黑色素生成量．

綜上,本研究合成了2種新型的無毒化合物,具有改善細(xì)胞黑色素合成調(diào)控的功能,對(duì)應(yīng)用于化妝品和制藥原料有潛在開發(fā)價(jià)值,且涉及到的咖啡酸衍生物合成及其對(duì)酪氨酸酶激活作用的研究方法,為治療酪氨酸酶低表達(dá)引起的相關(guān)疾病提供了理論依據(jù)．

[1] FRIEDMAN M.Food browning and its prevention:an overview[J].J Agric Food Chem,1996,44(3):631-653.

[2] 劉曉丹,黃磺,陳清西.苯甲酸對(duì)蘑菇酪氨酸酶抑制作用機(jī)理的研究 [J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003,42(1):102-107.

[3] DENG X Q,GONG S Z,ZHANG M Q.Caffeic acid activation of tyrosine enzyme catalytic reaction dynamics research [J].J Food Science,2008,29:98-101.

[4] FANG D,KUTE T,SETALURI V.Regulation of tyrosinase-related protein-2(TYRP2) in human melanocytes:relationship to growth and morphology [J].Pigment Cell Res,2001,14:132-139.

[5] NERYA O,VAYA J,MUSA R,et al.Glabrene and isoliquiritigenin as tyrosinase inhibitors from licorice roots [J].J Agr Food Chem,2003,51(5):1201-1207.

[6] HEARING V J,TSUKAMOTO K.Enzymatic control of pigmentation in mammals [J].FASEB J,1991,5(14):2902-2909.

[7] GRIMES P E,HAMZAVI I,LEBWOHL M,et al.The efficacy of afamelanotide and narrowband UV-B phototherapy for repigmentation of vitiligo [J].JAMA Dermatol,2013,149(1):68-73.

[8] YE Y,CHOU G X,WANG H,et al.Flavonoids,apigenin and icariin exert potent melanogenic activities in murine B16 melanoma cells [J].Phytomedicine,2010,18(1):32-35.

[9] MICHALUART P,MASFERRER J L,CAROTHERS A M,et al.Inhibitory effects of caffeic acid phenethyl ester on the activity and expression of cyclooxygenase-2 in human oral epithelial cells and in a rat model of inflammation [J].Cancer Res,1999,59(10):2347-2352.

[10] TOLBA M F,OMAR H A,AZAB S S,et al.Caffeic acid phenethyl ester:a review of its antioxidant activity,protective effects against ischemia-reperfusion injury and drug adverse reactions [J].Crit Rev Food Sci Nutr,2016,56(13):1549-7852.

[11] CHEN Q X,SONG K K,WANG Q,et al.Inhibitory effects on mushroom tyrosinase by some alkylbenzaldehydes [J].Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry,2003,18(6):491-496.

[12] KIM Y J,UYAMA H.Tyrosinase inhibitors from natural and synthetic sources:structure,inhibition mechanism and perspective for the future [J].Cell Mol Life Sci,2005,62:1707-1723.

[13] 鄧軼韜,丁玉梅,李華亮,等.鱷膽素聯(lián)合阿霉素對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的抑制作用 [J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2015,54(6):796-801.

[14] CUI T T,YI X L,ZHANG W G,et al.miR-196a-2 rs11614913 polymorphism is associated with vitiligo by affecting heterodimeric molecular complexes of Tyr and Tyrp1 [J].Arch Dermatol Res,2015,307(8):683-692.