柴瑩，周影，陳曉敏，童茂清

（寧波市第一醫(yī)院，浙江 寧波 315010，1.中西醫(yī)結(jié)合科；2.分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室；3.心內(nèi)科）

心律失常是心血管系統(tǒng)常見(jiàn)病、多發(fā)病，心肌細(xì)胞的異常興奮（如離子通道功能異常等）和細(xì)胞間傳導(dǎo)異常（如縫隙連接蛋白異常等）是心律失常發(fā)生的主要原因。鑒于心律失常發(fā)病的顯著節(jié)律性，大量研究探索了生物鐘與心律失常的可能聯(lián)系。YAMASHITA等[1]的研究顯示，幾種心臟鉀離子通道基因的表達(dá)有顯著的節(jié)律性。本課題組前期研究提示，視上核可能通過(guò)自主神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)著心臟離子通道的節(jié)律性表達(dá)[2]。然而，心臟縫隙連接蛋白基因的表達(dá)是否同樣具有節(jié)律性，及其與生物鐘系統(tǒng)的相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究觀察在小鼠心臟中縫隙連接蛋白基因的表達(dá)情況，以及生物鐘系統(tǒng)對(duì)縫隙連接蛋白基因的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡C57BL/6小鼠[購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（蘇）2010-0001]和Clock mutant小鼠（購(gòu)自美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室）各40只被單獨(dú)飼養(yǎng)在12 h光照/12 h黑暗環(huán)境下2周（8：00開(kāi)燈，20：00關(guān)燈），可自由進(jìn)食飲水。本研究通過(guò)寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利委員會(huì)批準(zhǔn)。1.2 RNA回收及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 在苯巴比妥鈉麻醉下，每6 h處死10只小鼠，快速回收心房、心室組織，保存于RNA保存液中（RNAlater，美國(guó)賽默飛世爾公司）。采用RNeasy1 Fibrous Tissue Mini kit（德國(guó)Qiagen公司）回收總RNA，反轉(zhuǎn)錄之前檢測(cè)RNA的濃度和純度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參，在StepOne-PlusTM（美國(guó)ABI公司）上檢測(cè)各基因mRNA水平。反應(yīng)條件為：94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)中使用的PCR引物見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 各基因的mRNA水平的24 h變化節(jié)律用least-squares cosine-curve fitting法分析。以下參數(shù)被用于分析晝夜節(jié)律的特點(diǎn)：①節(jié)律的顯著性；②周期性變化數(shù)值的算術(shù)平均值；③振幅和時(shí)相。各參數(shù)用 ±s表示，2組參數(shù)的比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Clock變異小鼠的生物鐘系統(tǒng)失去正常功能在野生型小鼠的心房和心室中，生物鐘基因Per2

和鐘控基因Dbp的mRNA水平顯示出顯著的晝夜節(jié)律性；在Clock變異小鼠中，兩基因表達(dá)均失去節(jié)律性，且各基因表達(dá)的均值和振幅均顯著低于野生型小鼠，表明該小鼠體內(nèi)的生物鐘系統(tǒng)失去正常功能。見(jiàn)圖1。

2.2 小鼠心臟中縫隙連接蛋白基因的表達(dá)呈顯著晝夜節(jié)律性 在野生型小鼠的心臟中，兩種縫隙連接蛋白基因Cx40和Cx43的mRNA水平具有顯著的晝夜節(jié)律性：在心房中，兩基因的表達(dá)峰值均出現(xiàn)在光照階段，而在心室中，僅Cx43的表達(dá)峰值出現(xiàn)在光照階段（見(jiàn)圖2）。在Clock變異小鼠中，心臟內(nèi)的兩種縫隙連接蛋白基因表達(dá)的節(jié)律性依然存在，但其節(jié)律的時(shí)相性發(fā)生顯著變化：在心房中，Cx40和

圖1 生物鐘基因在心房（A）和心室（B）中的表達(dá)情況（n=10）

圖2 縫隙連接蛋白基因在心房（A）和心室（B）中的表達(dá)情況（n=10）

Cx43的表達(dá)時(shí)相顯著后移；而在心室中，兩基因的表達(dá)時(shí)相顯著前移。Clock變異小鼠心室中兩基因表達(dá)的均值較野生型小鼠顯著增加，而兩基因表達(dá)的振幅及在心房?jī)?nèi)表達(dá)的均值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2-3。

表2 各基因在野生型及Clock變異小鼠心房中的表達(dá)節(jié)律相關(guān)參數(shù)比較（n=10， ±s）

表3 各基因在野生型及Clock變異小鼠心室中的表達(dá)節(jié)律相關(guān)參數(shù)比較（n=10， ±s）

3 討論

心律失常的發(fā)生與異常心肌細(xì)胞電活動(dòng)及（或）細(xì)胞間電傳導(dǎo)異常相關(guān)，這涉及一系列的心臟離子通道和縫隙連接蛋白基因。在過(guò)去40多年里，大量證據(jù)提示了縫隙連接和縫隙連接蛋白對(duì)正常心臟功能的重要性[3-4]。縫隙連接蛋白是構(gòu)成縫隙連接的基本單位，現(xiàn)在已知的縫隙連接蛋白有20多種，其中有4種在心臟中表達(dá)，包括Cx40、Cx43、Cx45和Cx30.2[5]。在心血管疾病中，其分布異常或表達(dá)下調(diào)，從而導(dǎo)致心律失?；|(zhì)的產(chǎn)生。例如慢性壓力超負(fù)荷/左室收縮功能不全大鼠模型中，心肌細(xì)胞Cx43陽(yáng)性縫隙連接的減少和（或）分布異常與房顫的高發(fā)密切相關(guān)[6]，心肌細(xì)胞縫隙連接重塑也與高甘油三酯血癥大鼠增加的室顫發(fā)生率相關(guān)[7]

心律失常的發(fā)病有顯著的晝夜節(jié)律性，研究表明這與離子通道基因表達(dá)及功能的節(jié)律性、心臟生理功能對(duì)自主神經(jīng)系統(tǒng)的反應(yīng)有關(guān)[8]。哺乳動(dòng)物的生物鐘中樞位于下丘腦的視上核，此外在包括心臟的幾乎所有的外周臟器中均存在外周生物鐘系統(tǒng)。視上核通過(guò)自主神經(jīng)/神經(jīng)體液途徑發(fā)出的信號(hào)驅(qū)動(dòng)并同步化各種行為和生理過(guò)程的節(jié)律。當(dāng)視上核被破壞后，這種節(jié)律性被打亂并引起一系列的下游效應(yīng)[9]。

本研究利用Clock變異小鼠觀察了Cx40和Cx43基因在心臟中的表達(dá)節(jié)律，Per2和Dbp基因被用作正常生物鐘系統(tǒng)功能的標(biāo)志，結(jié)果顯示在野生型小鼠中，Cx40和Cx43的表達(dá)呈顯著節(jié)律性，而在Clock變異小鼠中，這種節(jié)律性雖然保持，但其時(shí)相發(fā)生顯著變化，這意味著在正常的生物鐘功能缺失的情況下，縫隙連接蛋白基因的表達(dá)與外界環(huán)境失去同步性。

許多心血管參數(shù)如血壓、心率等均表現(xiàn)出明顯晝夜變化，這一現(xiàn)象之前主要被歸因于外界環(huán)境刺激的晝夜變化。隨著對(duì)生物鐘系統(tǒng)研究的不斷深入，生物鐘在心血管系統(tǒng)中的作用日益受到重視。生物鐘可能給心臟提供了一種手段，使得心血管系統(tǒng)可以“預(yù)測(cè)”外界環(huán)境的變化，從而可以提前做好準(zhǔn)備并做出最適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)，而生物鐘系統(tǒng)功能的異?？赡軙?huì)損害這一機(jī)制進(jìn)而導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生[10-11]。HAVAKUK等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，夜班輪班工人的心血管疾病發(fā)病率高于白班輪班工人，提示反復(fù)變化的作息時(shí)間可能導(dǎo)致生物鐘系統(tǒng)功能受損，進(jìn)而導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生。反之，心血管疾病也可能導(dǎo)致其本身的外周生物鐘系統(tǒng)的異常，進(jìn)而加重原有疾病。YOUNG等[13]報(bào)道，在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中，心臟的生物鐘系統(tǒng)功能受損。本研究顯示在機(jī)體生物鐘系統(tǒng)喪失正常功能時(shí)，Cx40和Cx43基因表達(dá)節(jié)律紊亂，這可能導(dǎo)致心臟電生理功能無(wú)法與機(jī)體的需求同步。

本研究結(jié)果提示了生物鐘系統(tǒng)可能參與了縫隙連接蛋白基因的節(jié)律性表達(dá)，而生物鐘功能異常會(huì)引起這一節(jié)律的紊亂，在未來(lái)研究中深入觀察在各種心血管疾病患者及動(dòng)物模型中生物鐘與縫隙連接蛋白基因的相關(guān)性將有可能進(jìn)一步闡明這一調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，并有可能發(fā)現(xiàn)新的心律失常的治療靶點(diǎn)，而對(duì)每個(gè)患者個(gè)體生物節(jié)律的評(píng)估則有可能為疾病的個(gè)體化治療提供更多依據(jù)。