王利華，王佳慧，韓艷云，朱運(yùn)峰，吳文輝，肖康飛，戰(zhàn)藝芳，曾令文

武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與安全研究所，湖北 武漢 430074

孔雀石綠（malachite green，MG），結(jié)構(gòu)式見圖1，是一種人工合成的三苯甲烷類有機(jī)化合物，既是染料也是細(xì)菌、真菌等的優(yōu)質(zhì)殺菌劑［1］。因其對(duì)水產(chǎn)類魚蝦體水霉病、魚卵水霉病以及鰓霉病等細(xì)菌性疾病有良好的防治效果，20世紀(jì)30年代起就被廣泛用于漁業(yè)生產(chǎn)［2］。MG加入養(yǎng)殖水中后，容易被魚、蝦等吸收并代謝為無色MG，兩者均具有較高毒性和致癌性［3-4］。因此，自20世紀(jì)90年代開始，世界上許多國家相繼禁止其在可食用的水產(chǎn)類養(yǎng)殖中使用。我國于2002年也將MG列入了《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》，并明確禁止其用于所有食用動(dòng)物的養(yǎng)殖［5］。盡管如此，由于MG殺菌的高效性、廉價(jià)性，且暫時(shí)沒有其他理想的替代藥物，目前一些不法漁民仍將其用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，這種不法行為勢(shì)必對(duì)人們的生命健康造成重大隱患。因此，在水產(chǎn)類產(chǎn)品流入市場之前，有必要進(jìn)行MG檢測(cè)。

圖1 孔雀石綠鹽酸鹽的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of malachite green hydrochloride

MG傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要有液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等［6-7］。盡管這些方法靈敏度高、準(zhǔn)確度高，但均需要大型昂貴的儀器、專業(yè)的操作人員以及復(fù)雜的樣品前處理等，檢測(cè)時(shí)間長，無法滿足水產(chǎn)類產(chǎn)品日益增長的現(xiàn)場快速篩查需求。表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)（surface enhanced Raman scattering，SERS）作為一種新興的指紋光譜式檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高、特異性好、檢測(cè)快速、操作簡便且可實(shí)現(xiàn)無損檢測(cè)的特點(diǎn)，在食品安全快檢領(lǐng)域越來越受到重視［8-10］，它是現(xiàn)有快檢方法中最有可能實(shí)現(xiàn)“傻瓜式”檢測(cè)的技術(shù)之一。近年來，基于SERS技術(shù)的MG現(xiàn)場檢測(cè)方法已有相關(guān)報(bào)道。例如，顧振華等［11］基于納米金和便攜式拉曼光譜儀發(fā)展了一種養(yǎng)殖水中孔雀石綠快速檢測(cè)方法。盡管該方法簡單、快速，但靈敏度不夠高，檢測(cè)限為5.0 μg/L。眾所周知，SERS技術(shù)最核心的內(nèi)容是制備均一性好、增強(qiáng)效果好的金/銀納米材料充當(dāng)增強(qiáng)基底實(shí)現(xiàn)待測(cè)對(duì)象的高靈敏檢測(cè)。在金/銀納米材料中，盡管納米金具有良好的穩(wěn)定性，但其增強(qiáng)效果明顯劣于銀納米材料；而單純的銀納米材料在空氣中又易氧化［12］。因此，考慮到銀包金材料不僅具有良好的穩(wěn)定性且增強(qiáng)效果非常好，本文通過晶種增長-抗壞血酸室溫還原法合成了Au@Ag納米材料，并以此為基底，采用SERS技術(shù)，成功構(gòu)建了一種基于便攜式拉曼光譜儀的MG現(xiàn)場快速高靈敏檢測(cè)方法，實(shí)際可實(shí)現(xiàn)的檢測(cè)限低至0.5 μg/L。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

紫外可見吸收光譜（ultraviolet-visible absorption spectrum，UV-vis）在 UV 分光光度計(jì)（Shimadzu，UV-2600）上采集。樣品的透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）圖在FEI Tecnai G2 20透射電子顯微鏡（TWIN，Japan）上測(cè)定。樣品的SERS光譜在海洋光學(xué)亞洲分公司生產(chǎn)的便攜式拉曼光譜儀Accuman SR-510 Pro上采集，其所用的激光光源波長為（785±0.5）nm，功率350 mW。對(duì)于每一個(gè)樣品，均在基底的不同位置至少采集3個(gè)SERS光譜，然后取平均值。

氯金酸購自上海九鼎化學(xué)科技有限公司，抗壞血酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%～100.5%）、檸檬酸鈉和檸檬酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%）購自美國Sigma-Aldrich公司，硝酸銀購自中國上海試劑一廠，MG購自蘇州快捷康生物技術(shù)有限公司，結(jié)晶紫（crystal violet，CV）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有其它試劑均為分析純或更高純度，且使用前未進(jìn)一步處理。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水（阻值大于18.2 MΩ·cm），基圍蝦購自武漢市白沙洲大市場。

1.2 納米金的合成

納米金的合成參照文獻(xiàn)［13］采用兩步增長法合成。首先，合成增長所需的晶種。典型的過程如下：在燒瓶中，加入 2.5 mL HAuCl4·3H2O（質(zhì)量濃度為2 g/L）溶液，稀釋至50 mL，劇烈攪拌，加熱至沸騰后，快速加入2 mL檸檬酸鈉-檸檬酸混合溶液（其質(zhì)量濃度分別為10 g/L和5 g/L）。繼續(xù)加熱攪拌5 min，冷卻至室溫備用。

第一步增長：取3 mL晶種稀釋至20 mL，室溫下劇烈攪拌，將溶液A和B同時(shí)緩慢加入燒瓶中；之后在油浴條件下加熱至沸騰，繼續(xù)攪拌30 min，最后冷卻至室溫。

第二步增長：取4.5 mL第一步增長獲得的溶液稀釋至20 mL，室溫下劇烈攪拌，將溶液A和B分別同時(shí)緩慢加入燒瓶中；之后在油浴中加熱至沸騰，繼續(xù)攪拌30 min，最后冷卻至室溫備用。

以上兩步增長中溶液A和溶液B的配制：

溶液A：2 mL HAuCl4·3H2O（質(zhì)量濃度為2 g/L）溶液用水稀釋至10 mL；

溶液B：0.5 mL抗壞血酸和0.25 mL檸檬酸鈉（其質(zhì)量濃度均為10 g/L）混合用水稀釋至10 mL。

1.3 Au@Ag納米顆粒的合成

Au@Ag納米顆粒的合成參照文獻(xiàn)［14］進(jìn)行。典型的合成過程如下：在5 μL納米金溶液中依次加入200 mL檸檬酸鈉溶液（38.8 mmol/L）、50 μL抗壞血酸溶液（0.1 mol/L），室溫劇烈攪拌下緩慢加入200 μL硝酸銀溶液（0.01 mol/L），持續(xù)劇烈攪拌約15 min后，將產(chǎn)物保存在4oC冰箱中備用。

1.4 MG標(biāo)準(zhǔn)品以及實(shí)際樣的SERS檢測(cè)

MG標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取1.0 mg MG標(biāo)準(zhǔn)品粉末溶于1 mL乙腈中，制得1 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后用水依次稀釋不同倍數(shù)，分別配制100 μg/L、50 μg/L、10 μg/L、5 μg/L、3 μg/L、2 μg/L、1 μg/L的MG標(biāo)準(zhǔn)溶液。

MG標(biāo)準(zhǔn)品的SERS檢測(cè)：200 μL Au@Ag納米粒子溶液中，依次加入30 μL助劑H（NaCl和KBr的混合溶液），200 μL待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后進(jìn)行SERS測(cè)試。采集頻率為5 s 5次。CV標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)試與MG類似，只需將MG標(biāo)準(zhǔn)品換成CV標(biāo)準(zhǔn)品即可。

MG實(shí)際樣檢測(cè)：首先，將菜市場購買的基圍蝦蝦肉在國標(biāo)的基礎(chǔ)上稍加改變進(jìn)行相關(guān)的前處理，直接檢測(cè)時(shí)并未檢出。隨后將處理后獲得的溶液用作基質(zhì)，向其中加入MG的標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成模擬樣本進(jìn)行檢測(cè)。具體測(cè)試過程與標(biāo)準(zhǔn)品類似。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米金和Au@Ag納米粒子的表征

首先，對(duì)納米金的合成過程進(jìn)行了UV-vis表征。如圖2（a）所示，初始合成的晶種顆粒在518.5 nm處有最大吸收峰，其可歸屬為納米金的表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）峰。隨著HAuCl4溶液的加入，逐步增長后，該峰依次紅移至520 nm和535 nm。對(duì)二次增長合成的金顆粒進(jìn)一步進(jìn)行TEM表征發(fā)現(xiàn)，此時(shí)的金顆粒為球形，且分散性較好、粒徑較均一，如圖2（a）中的插圖所示。由于Au@Ag納米粒子的SERS增強(qiáng)效果明顯優(yōu)于納米金［12］，以二次增長合成的金納米顆粒為種子，進(jìn)一步合成了Au@Ag納米粒子。從圖2（b）中UV-vis可以看出，相對(duì)金納米顆粒而言，此時(shí)的Au@Ag納米粒子在402 nm和521 nm處有兩個(gè)最大吸收峰，其分別歸屬為Au@Ag納米粒子中銀殼和金核的SPR峰。Au@Ag鈉米粒子的TEM結(jié)果表明，因銀殼的包裹，此時(shí)粒子的粒徑相對(duì)增大，約100 nm，如圖2（b）中的插圖所示。

圖2 （a）納米金和（b）Au@Ag納米粒子的UV-vis和TEM圖Fig.2 UV-vis and TEM images of（a）Au nanoparticles and（b）Au@Ag nanoparticles

2.2 MG的表面增強(qiáng)拉曼光譜圖

用SERS技術(shù)對(duì)10 μg/L MG的可行性檢測(cè)進(jìn)行了驗(yàn)證。如圖3所示，Au@Ag納米粒子及Au@Ag納米顆粒-助劑H的混合溶液均沒有明顯拉曼峰。當(dāng)10μg/LMG標(biāo)準(zhǔn)溶液加入后，在438cm-1、1170cm-1、1 617 cm-1處均顯示出MG的特征峰，這與文獻(xiàn)［15-16］報(bào)道一致，可作為MG定性檢測(cè)的依據(jù)。

圖3 不同溶液的SERS圖Fig.3 SERS spectra of different solutions

2.3 MG檢測(cè)條件的優(yōu)化

為提高M(jìn)G檢測(cè)的靈敏度，本文對(duì)測(cè)試過程中Au@Ag納米粒子中銀層厚度、Au@Ag納米粒子的體積、助劑H的體積以及MG樣品的加樣順序進(jìn)行了優(yōu)化，該優(yōu)化過程均以3 μg/L MG在1 617 cm-1處峰作為參考（見圖4中虛線框）。

由于不同銀層厚度的Au@Ag納米粒子增強(qiáng)效果不一樣，通過固定Au@Ag納米粒子合成過程中納米金的粒徑以及改變AgNO3加入的量，首先對(duì)Au@Ag納米粒子的銀層厚度進(jìn)行了優(yōu)化。如圖4（a）所示，隨著AgNO3體積的增加，Au@Ag納米粒子中銀殼逐漸變厚，SERS增強(qiáng)效果逐漸明顯；當(dāng)AgNO3體積增加至 200 μL時(shí)，1 617 cm-1處峰強(qiáng)達(dá)到最大；而當(dāng)AgNO3體積繼續(xù)增加時(shí)，形成的Au@Ag納米粒子溶液變得更加渾濁且容易聚沉，增強(qiáng)效果有下降的趨勢(shì)。因此，選取AgNO3的最佳體積為200 μL。

接著，對(duì)增強(qiáng)試劑的量進(jìn)行了優(yōu)化。如圖4（b）所示，隨著Au@Ag納米粒子體積的增加，MG在1 617 cm-1處峰強(qiáng)逐漸增大；當(dāng)體積增加至200 μL時(shí)，峰強(qiáng)達(dá)到最大值；繼續(xù)增加體積，增強(qiáng)效果有下降的趨勢(shì)。該現(xiàn)象表明，Au@Ag納米粒子的體積為200 μL時(shí)，MG在其表面的單分子層吸附已達(dá)到最大值。因此，選取Au@Ag納米粒子的最佳體積為200 μL。

本文中助劑H為NaCl和KBr的混合溶液，其加入Au@Ag納米粒子溶膠中后會(huì)導(dǎo)致納米顆粒發(fā)生聚集，使其局域等離子電磁場發(fā)生變化，繼而在納米顆粒間產(chǎn)生許多“熱點(diǎn)”［17］。當(dāng)MG分子處于這些“熱點(diǎn)”位置時(shí)，其拉曼信號(hào)會(huì)得到極大增強(qiáng)。其中，納米顆粒聚集程度的高低直接影響“熱點(diǎn)”的數(shù)量以及溶膠的沉降速度；而聚集過程中處于“熱點(diǎn)”位置的MG分子數(shù)進(jìn)一步影響其拉曼信號(hào)的放大倍數(shù)，最終影響其檢測(cè)靈敏度。基于此，本文進(jìn)一步對(duì)助劑H的體積進(jìn)行了優(yōu)化。從圖4（c）可以看出，隨著助劑H體積的增加，1 617 cm-1處峰強(qiáng)逐漸增大；當(dāng)體積增加至30 μL時(shí)，峰強(qiáng)達(dá)到最大值；繼續(xù)增加體積，增強(qiáng)效果逐步下降，當(dāng)體積增加至80 μL時(shí)，1 617 cm-1處峰幾乎消失。該現(xiàn)象表明，當(dāng)助劑H體積為30 μL時(shí)，處于“熱點(diǎn)”位置的MG分子達(dá)到最大值，此時(shí)再增加助劑體積，導(dǎo)致Au@Ag納米顆粒聚集速度過快，很快下沉到檢測(cè)器皿底部，MG分子難以順利到達(dá)“熱點(diǎn)”位置，反而會(huì)影響MG拉曼信號(hào)的放大，起不到增強(qiáng)效果。因此，選取助劑H的最佳體積為30 μL。

圖4 檢測(cè)條件優(yōu)化：（a）不同體積AgNO3對(duì)應(yīng)的Au@Ag納米粒子；（b）Au@Ag納米粒子溶液體積；（c）助劑H體積；（d）加樣順序（體積單位：mL）Fig.4 Optimized test conditions：（a）Au@Ag nanoparticles with different volumes of AgNO3；（b）Volumes of Au@Ag nanoparticles；（c）Volumes of auxiliary H；（d）Order of sample added

最后，對(duì)檢測(cè)過程中的加樣順序進(jìn)行了優(yōu)化。如圖4（d）所示，當(dāng)待測(cè)液在助劑H之后加入時(shí)，1 617 cm-1處峰強(qiáng)明顯增大。這可能因?yàn)橹鷦┲械柠u素離子優(yōu)先吸附到Au@Ag納米粒子表面［18］，當(dāng)待測(cè)液加入時(shí)，更有利于促進(jìn)MG分子吸附到Au@Ag納米粒子表面，從而使增強(qiáng)效果變得更強(qiáng)。因此，選用增強(qiáng)試劑、助劑H、待測(cè)液為測(cè)試時(shí)的最佳加樣順序。

2.4 靈敏度實(shí)驗(yàn)

基于上述實(shí)驗(yàn)獲得的優(yōu)化條件，本文進(jìn)一步考察了該方法檢測(cè)MG的靈敏度情況。如圖5（a）所示，隨著MG質(zhì)量濃度的增加，其在1 617 cm-1處的特征峰逐漸增強(qiáng)。當(dāng)MG質(zhì)量濃度為0.5 μg/L時(shí)，其在 438 cm-1、1 170 cm-1、1 617 cm-1處的特征峰仍明顯可見。該方法最終檢測(cè)MG的線性范圍為0.5 μg/L～10 μg/L（R2=0.991），如圖 5（b）所示，實(shí)際可檢測(cè)到的最低濃度為0.5 μg/L，優(yōu)于現(xiàn)有基于便攜式拉曼光譜儀的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道（例如，顧振華等［11］檢測(cè)養(yǎng)殖水中孔雀石綠檢測(cè)限為 5 μg/L、李春穎等［19］檢測(cè)孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)限為0.8 μg/L），表明該方法檢測(cè)MG靈敏度很高。

此外，CV與MG具有類似的殺菌作用，常被一起用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中［20-21］。因此，本文嘗試用該方法對(duì)CV進(jìn)行測(cè)試。從圖6（a）可以看出，該方法對(duì)1 μg/L CV具有非常好的測(cè)試效果，其在802 cm-1、941 cm-1、1 170 cm-1、1 620 cm-1處的特征峰信號(hào)非常明顯［14］。

2.5 實(shí)際樣測(cè)試

將基圍蝦蝦肉進(jìn)行前處理，與增強(qiáng)試劑Au@Ag納米粒子以及助劑H混合后，直接進(jìn)行SERS檢測(cè)，未檢出MG。為測(cè)試該方法在實(shí)際樣本中的檢測(cè)能力，以蝦肉前處理獲得的溶液作為基質(zhì)，配制10 μg/L和20 μg/L的MG模擬樣本溶液進(jìn)行測(cè)試。如圖6（b）所示，由于提取液中非組分（如小分子蛋白質(zhì)）的干擾，拉曼譜圖中熒光背景增強(qiáng)明顯，拉曼峰強(qiáng)度較同濃度標(biāo)準(zhǔn)品有明顯下降。盡管如此，模擬樣本中MG質(zhì)量濃度為10 μg/L時(shí)，其特征峰仍較好分辨。該結(jié)果表明，作為一種快速定性檢測(cè)方式，該方法有望應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)中。

圖5 （a）不同濃度MG的SERS圖；（b）工作曲線（質(zhì)量濃度單位：μg/L）Fig.5 （a）SERS spectra of Au@Ag nanoparticles with different MG mass concentrations；（b）Working curve

圖6 （a）1 μg/L CV的SERS圖；（b）MG模擬樣本的SERS圖Fig.6 （a）SERS spectrum of CV with 1 μg/L；（b）SERS spectra of artificial MG samples

3 結(jié) 語

本文采用晶種增長法合成粒徑較均一、分散性良好的納米金，并以此為種子進(jìn)一步合成了Au@Ag納米粒子?；谠摬牧蟽?yōu)良的SERS增強(qiáng)效果以及便攜式拉曼光譜儀，成功構(gòu)建了一種簡單、快速、高靈敏的MG的現(xiàn)場定性檢測(cè)方法，對(duì)MG標(biāo)準(zhǔn)品可以實(shí)現(xiàn)低至0.5 μg/L的檢測(cè)。進(jìn)一步的實(shí)際樣測(cè)試表明，該方法有望用于魚肉、蝦肉等水產(chǎn)品組織樣本中MG的現(xiàn)場快速篩查，對(duì)保障人們舌尖上的安全具有重要的意義。

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