林茂發(fā)　黃永輝　胡朝陽(yáng)　黃何何　高希

摘要：建立了對(duì)混合型飼料添加劑中大蒜素和香芹酚含量進(jìn)行檢測(cè)的氣相色譜方法。樣品采用乙醇提取，經(jīng)毛細(xì)管相色譜柱（HP-5，30m×0.32mm×0.25um）分離，氫火焰離子化檢測(cè)器測(cè)定，外標(biāo)法定量，并采用氣質(zhì)確證。方法學(xué)研究結(jié)果表明，目標(biāo)化合物二烯丙基二硫醚，二烯丙基三硫醚，香芹酚在0.01～10mg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為r≥0.9990，檢出限分別為10mg/kg、15mg/kg、10mg/kg；回收率為79.8～96.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.61～4.73%。該方法前處理簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確可靠，可以用于混合型飼料添加劑樣品中大蒜素和香芹酚的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：飼料添加劑；大蒜素；二烯丙基二硫醚；二烯丙基三硫醚；香芹酚；氣相色譜法；氣質(zhì)確證

我國(guó)是肉類(lèi)產(chǎn)品的消費(fèi)大國(guó)。人們消費(fèi)的肉類(lèi)產(chǎn)品主要是通過(guò)工廠化集約養(yǎng)殖的方式提供，工廠化養(yǎng)殖大多數(shù)采用配合飼料進(jìn)行飼養(yǎng)，優(yōu)質(zhì)的配合飼料是養(yǎng)殖成功的基礎(chǔ)，飼料質(zhì)量安全直接影響到肉類(lèi)的質(zhì)量安全，因此在提倡無(wú)公害養(yǎng)殖的同時(shí)飼料企業(yè)也在努力生產(chǎn)出安全、高效、環(huán)保的配合飼料，飼料添加劑作為配合飼料的重要組成是飼料企業(yè)投入大量科研開(kāi)發(fā)的項(xiàng)目之一，好的飼料添加劑可以提高飼料的利用率，減少動(dòng)物的發(fā)病幾率，促進(jìn)其生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

飼料添加劑產(chǎn)業(yè)多年的發(fā)展，尤其是中醫(yī)中藥技術(shù)在飼料添加劑中的應(yīng)用，大量以中草藥或者植物提取物為主要成分的綠色、高效的功能型飼料添加劑被開(kāi)發(fā)出來(lái)并投入飼料加工及養(yǎng)殖中，并且飼料添加劑的類(lèi)型也由單一的成分朝多種有效成分混合型的飼料添加劑發(fā)展，相對(duì)于種類(lèi)繁多的飼料添加劑產(chǎn)品。質(zhì)量監(jiān)管部門(mén)提供的檢測(cè)方法顯得有些不足，這給飼料添加劑質(zhì)量監(jiān)管帶來(lái)許多不便，因此有必要對(duì)各種新型飼料添加劑的檢測(cè)方法進(jìn)行開(kāi)發(fā)和研究。

本研究的對(duì)象為大蒜素和香芹酚混合型飼料添加劑，大蒜素是大蒜的主要提取物。其主要成分為二烯丙基二硫醚（dialM disulfide，DADS）和二烯丙基三硫醚（diallvl trisulfide，DATS），大蒜素用于飼料中具有消炎殺菌、改善飼料適口性、提高飼料效率的作用，是農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用的飼料添加劑之一。目前大蒜素的主要檢測(cè)方法有：重量法、容量法、氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜一質(zhì)譜法。香芹酚Carvacrol（2-甲基-5-異丙基苯酚）是我國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用的飼料藥物添加劑牛至油的主要成分，其中香芹酚已證明有很強(qiáng)的抗菌活性，能增強(qiáng)動(dòng)物體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，提高生長(zhǎng)性能和飼料利用率，目前香芹酚的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法和液相色譜法，但對(duì)同時(shí)檢測(cè)大蒜素和香芹酚的方法尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)，本實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)出采用氣相色譜法（GC-FID）同時(shí)檢測(cè)飼料添加劑中的大蒜素和香芹酚，并對(duì)目標(biāo)化合物采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法確證，實(shí)驗(yàn)證明該方法準(zhǔn)確快捷?？梢杂糜谠撝酗暳咸砑觿┑臋z測(cè)。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與設(shè)備

氣相色譜儀帶自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)聯(lián)FID檢測(cè)器及配套工作站（日本SHIMADZU公司），石英毛細(xì)管柱（HP-5，30m×0.32mm×0.25um）美國(guó)Agilent公司，6890N/5973N氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agi，lent公司：HP-5MS石英毛細(xì)柱（30m×0.25mm×0.25μm）美國(guó)Agilent公司，BT224S分析天平，德國(guó)Sartorius公司；XH-B旋渦混均器，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司；探針式超聲波處理器（功率：450 W，昆山超聲儀器有限公司）

1.2材料與試劑

甲醇、乙醇、丙酮、正己烷均為分析純，香芹酚標(biāo)準(zhǔn)品純度大于99.0%（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司），二烯丙基二硫醚標(biāo)準(zhǔn)品純度大于98%（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司），二烯丙基三硫醚標(biāo)準(zhǔn)品純度大于98%（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司）。稱(chēng)取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品。用無(wú)水乙醇溶解轉(zhuǎn)移到容量瓶中，并逐級(jí)稀釋成實(shí)驗(yàn)所需的濃度。再配制成相應(yīng)濃度的混標(biāo)。

1.3力怯

1.3.1色譜條件：進(jìn)樣口溫度：250℃：色譜柱升溫程序：60℃保留2min，10℃/min升至200℃，保留5min。檢測(cè)器（FID）溫度280℃，載氣，氮?dú)猓兌炔恍∮?9.999%）：燃?xì)猓瑲錃猓兌炔恍∮?9.99%）；空氣（壓縮空氣）；氣體流量：柱流量，1.85mL/min；氫氣40mL/min；空氣400mL/min：尾吹氣，30mL/min；進(jìn)樣量：1μL；分流比：20：1。

1.3.2樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品1克（精確至0.0001g），置于50mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解，超聲10min后定容，搖勻。

1.3.3測(cè)定

在上述選定的色譜條件下，待儀器穩(wěn)定后，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液氣相色譜分析。

2結(jié)果與分析

2.1色譜方法條件的選擇

分別取空白基質(zhì)樣品，標(biāo)準(zhǔn)品和混合飼料添加劑樣品按上述前處理方法制備的溶液，按所述色譜條件測(cè)定。結(jié)果空白基質(zhì)樣品在目標(biāo)化合物保留時(shí)間處無(wú)雜質(zhì)峰干擾，見(jiàn)圖1，圖2和圖3，表明樣品中其他成分不干擾目標(biāo)化合物測(cè)定，并且能夠在最短的時(shí)間實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物完全分離，方法特異性強(qiáng)，適用于混合型飼料添加劑大蒜素和香芹酚含量測(cè)定。

2.2方法的線(xiàn)性范圍及檢測(cè)限

將香芹酚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（0.01mg/ml～10.00mg/ml）在上述的氣相色譜條件下進(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到相應(yīng)的線(xiàn)性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，根據(jù)3倍噪比計(jì)算方法的檢測(cè)限。結(jié)果見(jiàn)表1

2.3方法的回收率和精密度

向空白基質(zhì)樣品中分別添加I（5g/kg）、Ⅱ（10g/kg）、Ⅲ（50g/kg）三個(gè)濃度水平的混合標(biāo)樣，每個(gè)水平進(jìn)行6次平行測(cè)定，回收率和精密度結(jié)果見(jiàn)表2。endprint

2.4溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

按上述的前處理方法制備樣品溶液，按前述方法測(cè)定三種目標(biāo)化合物含量，樣品溶液密封保存在室溫環(huán)境中，隔2h、4h、8h、24h、48h測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果表明樣品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5色譜柱選擇

影響色譜柱組分分離效果的一個(gè)重要因素是固定相類(lèi)型，目標(biāo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和極性是本文主要考慮的因素，以大蒜素和香芹酚為主要原料的混合型飼料添加劑是以大蒜素中的二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、香芹酚和吐溫80、聚二醇400等助溶劑經(jīng)過(guò)加工混合而成的。因此選擇色譜柱除了要考慮二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、香芹酚的分子結(jié)構(gòu)外。還考慮減少基質(zhì)的干擾等因素。本實(shí)驗(yàn)采用了3種不同極性的色譜柱，HP-5、HP-50及HP-88毛細(xì)管色譜柱，綜合考慮靈敏度，峰形，分析時(shí)間，基線(xiàn)漂移等色譜分析因素。HP-5毛細(xì)管色譜柱效果最好，因此以HP-5毛細(xì)管色譜柱作為本試驗(yàn)用色譜柱。

2.6柱溫和柱流量的優(yōu)化選擇

在確定優(yōu)選色譜柱后，氣相色譜法中能夠影響目標(biāo)化合物分離效果的因素主要為色譜柱的升溫程序和色譜柱的氣體流量。由于二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、香芹酚之間的沸點(diǎn)差異較大，同時(shí)考慮溶劑聚焦等因素。本研究反復(fù)實(shí)驗(yàn)比較了不同的初始溫度、升溫速率、柱流量后，確定儀器參數(shù)為：進(jìn)樣口溫度：250℃；色譜柱升溫程序：60℃保留2min，10℃/min升至200℃。保留5min。氣體流量：柱流量，1.85mL/min；氫氣40mL/min：空氣400mL/min；尾吹氣，30mL/min；

2.7提取溶劑的選擇

本研究實(shí)驗(yàn)采用了甲醇、乙醇、丙酮作為樣品的提取溶劑，實(shí)驗(yàn)表明這3種溶劑均能很好地提取目標(biāo)化合物，由于乙醇較其他溶劑毒性小，價(jià)格便宜。易于購(gòu)買(mǎi)，所以本研究實(shí)驗(yàn)選擇無(wú)水乙醇作為提取溶劑。

3 GC/M確證

在空白基質(zhì)中添加濃度為50mg/kg水平的混標(biāo)，按1.3.2進(jìn)行前處理

質(zhì)譜條件：載氣為高純氦氣。流速為2.0ml/min；采用分流進(jìn)樣。分流比為20：1：進(jìn)樣口溫度為250℃，初始溫度為60℃。以10℃/min升至200℃保持5min，離子源為EI源；電子能量為70eV；傳輸線(xiàn)溫度270℃：離子源溫度230℃：四級(jí)桿溫度150℃；溶劑延遲3min。采用Scan掃描模式，m/z質(zhì)量掃描的范圍為50～500m/z?？傠x子流圖和質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4和圖5

4實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)企業(yè)生產(chǎn)的大蒜素和香芹酚混合型飼料添加劑進(jìn)行測(cè)定，準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品對(duì)企業(yè)生產(chǎn)的大蒜素和香芹酚混合型飼料添加劑進(jìn)行測(cè)定，準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品1克（精確至0.0001g），樣品加入無(wú)水乙醇溶解定容50mL，搖勻靜置。采用GC-FID測(cè)定，色譜譜圖見(jiàn)圖7，測(cè)定結(jié)果與產(chǎn)品明示值相符。

5.結(jié)論

本研究建立的氣相色譜法測(cè)定混合型飼料添加劑中二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、香芹酚的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)簡(jiǎn)單的樣品前處理和強(qiáng)特異性的優(yōu)點(diǎn)，并且具有較寬的線(xiàn)性范圍，具有十分顯著的線(xiàn)性關(guān)系，加標(biāo)回收率高，重現(xiàn)性好；使用儀器設(shè)備普及率高，可在混合型飼料添加劑中大蒜素和香芹酚的質(zhì)量檢測(cè)及標(biāo)準(zhǔn)制定中加以推廣應(yīng)用。endprint