問鑫　高鳳仙

摘要：抗菌肽作為抗生素替代品的首選，得到了大量的研究。本文詳細(xì)的綜述了抗菌肽殺菌的作用機(jī)理，分別闡述了抗菌肽的作用機(jī)制及對母豬生產(chǎn)性能的影響。

關(guān)鍵字：抗菌肽；作用機(jī)理；膜損傷；母豬；生產(chǎn)性能

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是指在外界條件作用的刺激下由特定的基因編碼、由核糖體合成的一類可抵御外界微生物侵害、清除體內(nèi)抗微生物的小分子陽離子多肽，是動物非特異性免疫系統(tǒng)的重要效應(yīng)分子。本文綜述了抗菌肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、理化特性、作用機(jī)制及其在母豬生產(chǎn)中的應(yīng)用。

1抗菌肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與理化性質(zhì)

目前，已分離或預(yù)測出的抗菌肽超過1200種，但大部分抗菌肽只包含50或更少的氨基酸殘基，最短的抗菌肽僅有6個(gè)殘基，分子量較小。其N端含有賴氨酸、精氨酸等親水性氨基酸殘基，C端則富含丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸等疏水性氨基酸殘基，這使得抗菌肽有水脂兩親性結(jié)構(gòu)；同時(shí)，可賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸通常會使抗菌肽等電點(diǎn)大于7，表現(xiàn)出一定的陽離子特征，可與兩性分子或電負(fù)性細(xì)胞膜結(jié)合，與細(xì)菌的細(xì)胞膜發(fā)生作用?？咕牡闹虚g部分含有大量的脯氨酸和二硫鍵，由此易形成α-螺旋、β-折疊、伸展片層結(jié)構(gòu)和環(huán)形等與其抗菌活性密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)。

作為抗生素替代物的首選?？咕木哂幸韵绿攸c(diǎn)：（1）廣譜抗菌活性：抗菌肽不僅能殺滅革蘭氏陽性、陰性菌、真菌、病毒、原蟲，并對腫瘤和癌細(xì)胞有一定的殺傷作用：（2）熱穩(wěn)定性：抗菌肽具有較強(qiáng)的耐熱性，在沸水中30min仍可保持較高的抗菌活性，可耐受飼料制粒的高溫過程：（3）高效性：抗菌肽對病原微生物的最小抑菌濃度（MIC）僅為0.1～10μg/ml，并且可在極短的時(shí)間內(nèi)殺滅所有病原體：（4）特異性：盡管抗菌肽是動物先天性防御系統(tǒng)的產(chǎn)物，但是具有特異性，只對原核生物細(xì)胞和病變的真核細(xì)胞產(chǎn)生作用，對其他微生物和健康的真核細(xì)胞無殺傷作用；（5）抗水解：有些抗菌肽可抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶的水解，使其可在動物體內(nèi)完整的發(fā)揮作用。此外，抗菌肽還有水溶性好、不殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)。

2抗菌肽對母豬的影響及其作用機(jī)理

隨著近年來養(yǎng)豬生產(chǎn)的集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖戶將大量精力放在了提高生長和產(chǎn)肉性能等方面上，使母豬長期處于應(yīng)激狀態(tài)中，引起母豬的內(nèi)分泌機(jī)能失調(diào)、食欲不振、體脂含量降低等應(yīng)激反應(yīng)，并加劇了母豬泌乳障礙，直接影響了仔豬的成活率和生長性能，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。作為抗生素替代品的首選，將抗菌肽加入母豬日糧中，可提高母豬的生產(chǎn)性能。

2.1抑殺影響母豬生產(chǎn)的病毒

豬呼吸與繁殖綜合癥（PRRSV）和豬圓環(huán)病毒?。≒CV-2）是影響我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的兩個(gè)巨大障礙，其可使豬群生產(chǎn)性能下降，母豬流產(chǎn)增多。萬小平等（2011）采用融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2加入后備母豬日糧中，研究發(fā)現(xiàn)，融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2可有效減少體內(nèi)PCV-2、PRRSV的帶毒率；處理后備母豬血液PCV-2、PRRSV病毒含量也明顯減少。顯示飼喂融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2產(chǎn)生了良好的抑制及清除病毒的作用，對降低后備母豬體內(nèi)PCV-2、PRRSV帶毒率有明顯成效。說明抗菌肽具有防治常見疾病的前景。此外，有研究表明，抗菌肽對提高豬瘟抗體水平，改善抗體均勻度方面具有十分顯著的效果，充分驗(yàn)證了抗菌肽對調(diào)節(jié)動物免疫機(jī)能、增強(qiáng)動物免疫力方面的作用。

其增強(qiáng)母豬免疫力的主要機(jī)理為：抗菌肽可抑制病毒DNA合成的過程，還可通過阻礙其復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，影響蛋白質(zhì)的翻譯過程，間接的抑制病毒蛋白質(zhì)合成。王軍和龐廣昌（2005）報(bào)道，抗菌肽Attacin可干擾大腸桿菌的膜蛋白轉(zhuǎn)錄，阻礙蛋白質(zhì)合成，從而增加細(xì)胞膜的通透性。殺滅細(xì)菌?？咕腎ndolicidin可通過與脂多糖的相互結(jié)合，達(dá)到抑制蛋白質(zhì)合成的效果。ZHOU和CHEN（2011）研究了抗菌肽apidaecins的亞型apidaecin IB與大腸桿菌膜蛋白的作用。發(fā)現(xiàn)大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入apidaecin IB，可使維持膜脂平衡的ftsH過量分泌。阻礙了膜蛋白合成的第一個(gè)關(guān)鍵步驟，抑制其合成。Yenugu等（2004）報(bào)道，抗菌肽HE2的幾個(gè)亞型（HE2al-pha、HE2betal和HE2beta2）不但可與大腸桿菌細(xì)胞膜作用使胞內(nèi)物質(zhì)泄露，還可抑制其DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成。

劉立偉和鄧?yán)冢?012）報(bào)道，抗菌肽能刺激細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的物質(zhì)如鈣離子和蛋白酶排入細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)一步刺激線粒體釋放細(xì)胞色素C，通過一系列酶促反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有些抗菌素如thanatin、histatin還可抑制細(xì)胞呼吸作用。進(jìn)而抑殺細(xì)菌。此外，LIU等（2013）采用包含誘導(dǎo)表達(dá)的抗菌肽LL-37的穿梭載體，研究大腸桿菌要有氧或無氧條件下的生長狀況，研究發(fā)現(xiàn)。LL-37會使大腸桿菌生長受阻，使細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榻z狀；同時(shí)，LL-37不僅可提高其在細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量，在有氧條件下引起致死膜去極化，增加胞膜的通透性，并且通過轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)LL-37可通過阻礙氧化磷酸化相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞糖代謝和能量轉(zhuǎn)化的過程以及細(xì)胞內(nèi)離子的氧化還原狀態(tài)。由此提出了一種新的靶向能量代謝的AMPs受體介導(dǎo)的殺菌機(jī)制。

2.2降低母豬死產(chǎn)率，提高仔豬成活率

皮燦輝等（2008a）用抗菌肽替代豬場使用的抗生素飼喂母豬和其所產(chǎn)仔豬，并對508頭母豬和它們分娩產(chǎn)生的5245頭豬仔進(jìn)行追蹤統(tǒng)計(jì)并記錄其健康狀況。結(jié)果表明，試驗(yàn)組木乃伊死胎率僅為0.31%，比對照組（7.15%）降低了22倍。在哺乳階段，未使用抗菌肽飼料添加劑的對照組死亡率（2.36%）是試驗(yàn)組（0.35%）的7倍。在保育階段，未使用抗菌肽飼料添加劑的對照組死亡率（3.76%）是試驗(yàn)組（1.32%）的3倍。潘行正等（2010）研究了抗菌肽對減少母豬死胎率的效果，結(jié)果表明，添加抗菌肽制劑的母豬試驗(yàn)組死產(chǎn)率為5.77%，按日常用藥方案使用抗生素的對照組死產(chǎn)率為12.75%：其中試驗(yàn)組木乃伊胎的死產(chǎn)率僅為0.31%。對照組卻達(dá)到7.16%。添加抗菌肽制劑的試驗(yàn)組仔豬在哺乳期和保育期的死亡率分別為0.34%、1.31%，同期對照組分別為2.35%、3.65%；對照組死亡率顯著高于試驗(yàn)組?？梢娍咕闹苿┠茱@著降低母豬的死產(chǎn)率與提高仔豬的成活率與豬只的生產(chǎn)性能和健康水平。endprint

抗菌肽之所以能降低母豬死產(chǎn)率與提高仔豬成活率，與其廣譜的抗菌作用有關(guān)：細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分是肽聚糖，是維持細(xì)胞強(qiáng)度和形狀的外被，具有保護(hù)細(xì)胞形態(tài)的作用。當(dāng)細(xì)胞壁被破壞，細(xì)菌的形態(tài)及對滲透壓的敏感性都會產(chǎn)生變化，引起細(xì)胞死亡?？咕目赏ㄟ^破壞細(xì)胞壁和抑制細(xì)胞壁合成兩方面抑殺細(xì)菌。

Herusimenka等（2005）研究抗菌肽與細(xì)菌的相互作用時(shí)指出，二者之間的相互作用主要通過肽與多糖之間實(shí)現(xiàn)的。抗菌肽帶正電荷，可取代細(xì)胞壁表面的鎂離子，與細(xì)菌細(xì)胞壁上的負(fù)電荷物質(zhì)通過靜電引力結(jié)合，引起細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，形成細(xì)胞壁紊亂區(qū)域，促使抗菌肽穿過細(xì)胞壁。接近細(xì)胞膜。在革蘭氏陰性菌中，帶負(fù)電荷的物質(zhì)為脂多糖和莢膜多糖，而在革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁表面有帶負(fù)電荷的是磷壁酸。唐亞麗（2009）用抗菌肽MDpep5和MDpep9處理了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，結(jié)果表明，兩種細(xì)菌的A630nm值均有不同程度的下降，說明家蠅抗菌肽對細(xì)菌細(xì)胞壁有一定的溶解作用，可使細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性增加。喬媛媛等（2010）利用電子顯微鏡觀察了抗菌肽的作用機(jī)理，研究表明?？咕淖饔糜诖竽c桿菌12h后，細(xì)菌的質(zhì)壁發(fā)生分離。使細(xì)胞壁出現(xiàn)空泡。進(jìn)一步證明了抗菌肽可破壞細(xì)胞壁。宮霞等（2011）指出，抗菌肽MDL-2可與細(xì)菌細(xì)胞壁，使其溶解，對革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌的作用在較低濃度下即可發(fā)生，但對革蘭氏陰性菌的作用則需達(dá)到一定的濃度才可破壞其細(xì)胞壁。這可能與兩種菌表面的不同組分有關(guān)，在抗菌肽達(dá)到一定濃度時(shí)才能溶解革蘭氏陰性菌表面的脂多糖。

抗菌肽不僅可破壞、溶解細(xì)胞壁，并通過抑制細(xì)胞壁的合成來表達(dá)其抗菌活性。蔡永峰和彭德軒（2000）報(bào)道，桿菌肽鋅可抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成的脫磷酸化過程，阻礙磷脂載體的運(yùn)轉(zhuǎn)及向細(xì)胞壁支架輸送粘肽，從而抑制細(xì)胞壁的合成。Haster等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，Lipid Ⅱ是細(xì)胞壁的合成前體。而抗菌肽Nisin可移除Lipid Ⅱ在細(xì)胞壁上的合成位點(diǎn)。從而阻礙細(xì)胞壁的合成。Harder（2001）等指出?？咕摩?defensin3可抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的形成，使細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)異常、阻礙細(xì)菌分裂，導(dǎo)致細(xì)胞壁穿孔。引起細(xì)菌死亡。說明抗菌肽可通過阻斷細(xì)胞壁的合成過程或移除其合成所需的物質(zhì)來達(dá)到抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成的作用。

2.3提高妊娠母豬與仔豬的免疫力，節(jié)約生產(chǎn)成本

王阿榮（2011）將天蠶素抗菌肽加入母豬日糧中，研究發(fā)現(xiàn)。添加天蠶素抗菌肽對母豬的繁殖力和仔豬的生長性能等均無顯著影響（P>0.05），但是試驗(yàn)Ⅲ組在這兩項(xiàng)指標(biāo)上較對照組都有提高的趨勢：各試驗(yàn)組母豬初乳中的水分含量均高于對照組，但差異不顯著（P>0.05）。各試驗(yàn)組母豬初乳中乳糖含量均高于對照組，其中只有試驗(yàn)Ⅱ組與對照組差異顯著（P<0.05），其它試驗(yàn)組較對照組差異不顯著（P>0.05）。各試驗(yàn)組母豬初乳中氨基酸水平和脂肪酸含量與對照組相比均無顯著差異（P>0.05）。從試驗(yàn)整體結(jié)果看。在母豬日糧中添加60g/t天蠶素抗菌肽的試驗(yàn)Ⅲ組效果最佳。說明抗菌肽飼料添加劑可有效提高母豬的生產(chǎn)性能。并有效地降低飼養(yǎng)成本，為養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

由于抗菌肽提高了母豬和仔豬的免疫力，在生產(chǎn)中的用藥及人力上有了巨大的節(jié)約，可以進(jìn)一步為養(yǎng)殖戶帶來可觀的效益。在這里，筆者將為大家普及抗菌肽的幾種抗菌模式。使養(yǎng)殖戶更加明了的認(rèn)知抗菌肽。

2.3.1“桶板”模型（Barrel-stave model）

在該模型中，抗菌肽通過靜電引力聚集在胞膜表面，形成肽聚體，然后肽聚體的疏水部分垂直插入磷脂雙分子層破壞細(xì)胞膜，形成離子通道，使細(xì)胞滲透壓變化、胞質(zhì)泄露，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。唐亞麗（2009）指出，通過該模型產(chǎn)生抗菌作用的抗菌肽即可以單體形式，也可以多體形式與胞膜結(jié)合：當(dāng)單體在膜表面的密度較低時(shí)，可互相識別、聚合，形成多聚體；多肽和胞膜的疏水部分相互結(jié)合。形成離子通道：在離子通道形成過程中，可通過在“桶板”上增加單體及小多體，擴(kuò)大通道，加速細(xì)胞死亡。Gkeka和Sark-isov（2009）報(bào)道，抗菌肽跨膜形成的“桶板”通道的主要作用為α-螺旋。每6個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)的肽可形成內(nèi)徑0.52nm左右的螺旋肽，并由此形成“桶板”狀的通道，其中孔道內(nèi)側(cè)為肽的親水部分，外側(cè)為疏水部分。該模型說明抗菌肽具有兩親性，并說明具有兩親性的α-螺旋結(jié)構(gòu)的抗菌肽是形成膜孔洞的關(guān)鍵因素。另外，劉忠淵（2008a）指出，除了具有雙親性的α-螺旋，疏水性的α-螺旋或B折疊結(jié)構(gòu)也是使抗菌肽具有穿膜孔洞作用的必需結(jié)構(gòu)。

2.3.2“環(huán)孔”模型（Toroidal Dore model）

“環(huán)孔”模型最初是由Ludtke等在研究滑爪蟾素的作用機(jī)理時(shí)提出的，滑爪蟾素具有兩性α-螺旋結(jié)構(gòu)。與胞膜作用，可形成透膜孔道（劉立偉和鄧?yán)冢?012）。與“桶板”模型不同的是，抗菌肽與膜結(jié)合時(shí)形成明顯的α-螺旋結(jié)構(gòu)，肽的親水部分與脂質(zhì)的親水部分結(jié)合，共同形成跨膜通道。當(dāng)肽與磷脂的比例達(dá)到一定的值，抗菌肽互相結(jié)合。使膜表面的曲面張力變化，導(dǎo)致脂質(zhì)雙分子層內(nèi)外兩層貫通，改變胞膜結(jié)構(gòu)，從而形成環(huán)孔狀通道，最終引起細(xì)胞死亡。Bozelli等（2012）通過圓二色和熒光光譜對含13個(gè)殘基的陽離子抗菌肽TRP3和含不同脂質(zhì)的胞膜模型之間的作用進(jìn)行了研究，用大單層脂質(zhì)體（LUV）模擬肽一脂質(zhì)聚合體、用膠束模仿“環(huán)孔”模型的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，只有當(dāng)雙分子層有負(fù)電荷的磷脂，TRP3才能與其結(jié)合，而無論膠束表面電荷的正負(fù)。TRP3均可與之結(jié)合，說明靜電作用在“環(huán)孔”模型中不占主導(dǎo)作用，并指出。脂質(zhì)雙分子層的曲率可影響肽的二級結(jié)構(gòu)。Sobko等（2004）研究了大腸桿菌素E1（col-icinEl）在磷脂雙分子層和脂質(zhì)體上形成環(huán)孔通道的活性，指出colieinEl形成環(huán)孔通道的活性取決于脂質(zhì)雙分子層的曲率，說明脂質(zhì)直接參與了eolieinEl誘導(dǎo)孔壁形成的過程。并報(bào)道col-icinEl通過形成環(huán)孔通道。導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Yoneyama等（2009）報(bào)道，lacticin Q是一類可在細(xì)胞膜上形成孔隙的細(xì)菌素，并且是目前第一個(gè)可使蛋白泄露的抗菌肽。其形成孔隙的過程如下：首先，快速與細(xì)胞外膜結(jié)合：其次，形成至少4.6nm的孔隙，引起蛋白質(zhì)泄露：再次，lac-ticin Q從細(xì)胞膜外側(cè)遷移至膜內(nèi)側(cè)。

2.3.3“毯式”模型（Carpet model）

Pouny等（1992）在研究抗菌肽dermaseptin與磷脂膜的相互作用時(shí)提出了抗菌肽的“毯式”模型。當(dāng)濃度較低時(shí)陽離子抗菌肽分子以“平鋪”的方式覆蓋在帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面，平行于磷脂雙分子層。使其疏水部分與細(xì)胞膜結(jié)合：當(dāng)抗菌肽的濃度達(dá)到一定的閾值，抗菌肽互相結(jié)合形成肽聚體，肽聚體可與細(xì)胞膜結(jié)合，形成類似洗滌劑一脂質(zhì)混合物，使完整的細(xì)胞膜迅速崩潰、細(xì)胞膜被溶解，造成細(xì)胞內(nèi)容物流失、細(xì)胞死亡（Wimley，2010；劉忠淵，2008a）。Lopez-Oyama等（2011）對抗菌肽Bactenecin與細(xì)胞膜的相互作用進(jìn)行探究的過程中發(fā)現(xiàn)，使抗菌肽通過“毯式”模型產(chǎn)生抗菌作用的結(jié)構(gòu)主要是β-折疊結(jié)構(gòu)，這可能是由于β-折疊所特有的長絲狀網(wǎng)格是與細(xì)胞膜產(chǎn)生作用的主要結(jié)構(gòu)，F(xiàn)ernandez等（2012）分別用DMPC（二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿）和DMPC/DMPG（二肉豆蔻酰磷脂酰甘油）作為真核和原核的模型膜，研究了抗菌肽aurein1.2與胞膜的相互作用，結(jié)果表明，anrein1.2與兩種膜表面均有較強(qiáng)的相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)雙分子層的破壞和膜溶解，并根據(jù)不同類型的磷脂膜的結(jié)構(gòu)變化，說明該抗菌肽與膜作用的機(jī)制為“毯式”模型（如圖1所示）。

4展望

抗菌肽作為一種功能性添加劑用于分娩前后的母豬飼糧時(shí)，可以有效提高母豬的免疫機(jī)能和死產(chǎn)率、仔豬初生重和斷奶重，顯著降低哺乳期母豬產(chǎn)生的各種應(yīng)激以及仔豬的腹瀉率和死亡率，進(jìn)而提高整體養(yǎng)殖效益。對于1000頭母豬場而言，使用抗菌肽飼料添加劑可使年經(jīng)濟(jì)效益至少增加59.25萬元。

但有關(guān)于抗菌肽的研究還有以下問題有待解決：

（1）抗菌肽是動植物免疫系統(tǒng)受到刺激后產(chǎn)生的物質(zhì)。含量極微：雖然可利用化學(xué)方法合成，但成本較高，無法進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)；（2）抗菌肽種類很多，有廣譜的抗菌性：要發(fā)現(xiàn)一種生產(chǎn)成本低，使用效果好的抗菌肽添加劑，還需不斷的研究探索；（3）抗菌肽種類豐富，抗菌機(jī)理各不相同，目前仍沒有非常明確的、統(tǒng)一的理論；這急需研究者不斷總結(jié)歸納抗菌肽的作用機(jī)制，加快抗菌肽應(yīng)用的推廣。endprint