張 田， 付 蓉

(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院血液科， 天津 300052)

表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是指在基因核苷酸序列不發(fā)生變化的情況下，通過對轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控使基因表達(dá)發(fā)生變化，包括DNA甲基化、組蛋白共價修飾、染色質(zhì)重塑、基因印記、及非編碼RNA、微小RNA(miRNA)、反義RNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等[1]。環(huán)境、年齡改變、壓力、疾病狀態(tài)等，均可以引起免疫細(xì)胞表觀遺傳學(xué)改變，造成免疫系統(tǒng)功能紊亂，導(dǎo)致疾病的發(fā)生與進(jìn)展。因此，表觀遺傳學(xué)逐漸成為免疫學(xué)研究的熱點。

自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)是天然免疫細(xì)胞，主要來源于造血干細(xì)胞，全身廣泛分布。NK細(xì)胞通過一系列細(xì)胞生物學(xué)過程獲得激活信號，包括胞外鈣離子內(nèi)流、細(xì)胞骨架重排以及與靶細(xì)胞接觸部位免疫突觸形成，最終通過分泌細(xì)胞因子、趨化因子及釋放毒性顆粒執(zhí)行清除病毒、腫瘤細(xì)胞以及發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。NK細(xì)胞功能異常導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，包括感染、腫瘤及自身免疫疾病[2-3]。近年來，有很多學(xué)者先后報道了表觀遺傳學(xué)改變對NK細(xì)胞增殖、分化及功能的影響，為NK細(xì)胞研究提供了新思路，為新藥的臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。本文對NK細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展作一綜述。

1 表觀遺傳學(xué)對NK細(xì)胞分化的影響

人類NK細(xì)胞表面特異性表達(dá)CD56或CD16分子，根據(jù)其表達(dá)水平將NK細(xì)胞分為CD3-CD56brightCD16-(CD56bright)、CD3-CD56dimCD16+(CD56dim)、CD3-CD56-CD16+3個亞群[4]。其中CD56bright亞群為調(diào)節(jié)性NK細(xì)胞，可以參與適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)，通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子(IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-13和GM-CSF)對樹突狀細(xì)胞(DCs)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)、輔助性T細(xì)胞(Ths)及細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLs)等進(jìn)行免疫調(diào)控[5]。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，NK細(xì)胞可以通過分泌IFN-γ誘導(dǎo)B細(xì)胞活化，促進(jìn)DC細(xì)胞成熟，并可抑制T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化[6]。NK細(xì)胞分泌IFN-γ可以促進(jìn)DC細(xì)胞分泌IL-27，而IL-27可促進(jìn)IFN-γ分泌，這種正反饋參與抑制Th17介導(dǎo)的自身免疫疾病[7]。人和小鼠NK細(xì)胞均可通過分泌IFN-γ可以抑制CD4+T細(xì)胞向Tregs分化[8]。CD56dim為功能性NK細(xì)胞，通過穿孔素/顆粒酶途徑、Fas/FasL途徑、TNF-а/TNFR-1途徑、以及抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(ADCC)完成對靶細(xì)胞的直接殺傷。近期也有研究者發(fā)現(xiàn)，功能性NK細(xì)胞參與適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)，直接殺傷適應(yīng)性免疫細(xì)胞，如Th17及濾泡輔助性T細(xì)胞(Tfh)[9]。而CD3-CD56-CD16+亞群目前研究較少，目前認(rèn)為主要發(fā)揮ADCC作用。

表觀遺傳學(xué)修飾在NK細(xì)胞的分化、成熟中發(fā)揮了重要作用。早期的研究顯示，IL-15受體信號通路對NK細(xì)胞的分化成熟至關(guān)重要，E4BP4(NFIL3)在其中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)了造血干細(xì)胞(HSC)向NK細(xì)胞分化。動物實驗顯示，E4BP4基因缺陷小鼠NK細(xì)胞減少、功能下降，而過表達(dá)E4BP4可增加Id2和Gata3的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)HSC向NK細(xì)胞分化增加[10]。在NK細(xì)胞發(fā)育中，組蛋白甲基化也具有重要調(diào)控作用。Yin等[11]研究了zeste基因增強(qiáng)子同源物2(EZH2)對早期NK細(xì)胞分化的影響。EZH2作為重要的表觀遺傳修飾酶，是PcG(polycomb group)蛋白家族的重要成員，在調(diào)控基因表達(dá)的過程中起關(guān)鍵作用[12]。EZH2主要對組蛋白H3K27進(jìn)行甲基化，從而沉默下游基因，在細(xì)胞增殖、分化及腫瘤形成方面都有重要作用[13]。研究者[11]發(fā)現(xiàn)，在小鼠及人中，選擇性失活EZH2或用小分子抑制其活性后，可以增加IL-15受體(CD122+)陽性的NK祖細(xì)胞數(shù)量，并促進(jìn)成熟NK細(xì)胞增殖。NK細(xì)胞的擴(kuò)增及殺傷作用還與CD122及NKG2D有關(guān)，NKG2D缺失可降低EZH2抑制劑對促進(jìn)NK細(xì)胞增殖及分化的作用。另外，Tsuyama等[14]研究報道，NKT細(xì)胞淋巴瘤患者存在組蛋白去甲基化酶KDM6A基因突變，此基因與血液腫瘤關(guān)系密切，可能影響NK細(xì)胞的增殖。

FcγRIIIA(CD16a)由FCGR3A編碼，為 NK細(xì)胞在成熟過程中獲得。研究發(fā)現(xiàn)，在CD16a+細(xì)胞中，F(xiàn)CGR3A啟動子中轉(zhuǎn)錄起始位點的甲基化水平較CD16a-細(xì)胞和中性粒細(xì)胞明顯降低。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)miR-218是NK細(xì)胞CD16a轉(zhuǎn)錄后的負(fù)調(diào)控因子。在NK細(xì)胞中過度表達(dá)miR-218可降低CD16a的mRNA和蛋白表達(dá)水平，miR-218在CD16a-細(xì)胞中水平明顯高于CD16a+細(xì)胞。因此，研究者推斷，F(xiàn)CGR3A的轉(zhuǎn)錄起始位點甲基化及轉(zhuǎn)錄后miR-218的調(diào)控作用可以通過改變CD16a的表達(dá)來調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的分化成熟[15]。

記憶性NK細(xì)胞的概念由Sun等[16]最早提出。這類NK細(xì)胞可以長期存活，具有免疫記憶功能，當(dāng)再次接觸到“記憶”抗原時被激活。多種病毒可以誘導(dǎo)記憶性NK細(xì)胞產(chǎn)生，目前報道的有巨細(xì)胞病毒，單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒等[17-18]。記憶性NK細(xì)胞表達(dá)CD57和NKG2C，不表達(dá)FcR、SYK、DAB2、ETA-2、PLZF和ILZF2。FcR、ETA-2、SYK的缺乏均有表觀遺傳學(xué)機(jī)制的參與[19-20]。IL-12信號通路通過其下游轉(zhuǎn)錄因子信號和轉(zhuǎn)錄因子4(STAT4)的激活影響記憶性NK細(xì)胞的擴(kuò)增。Rapp等[21]發(fā)現(xiàn)Runx1和Runx3的啟動子區(qū)域是STAT4的結(jié)合位點，在NK細(xì)胞活化過程中，STAT4的結(jié)合會誘導(dǎo)RUNX基因位點的表觀遺傳學(xué)修飾，從而導(dǎo)致表達(dá)增加。在病毒感染中，Runx1和Runx3或它們的伴侶分子表達(dá)減低是影響NK細(xì)胞擴(kuò)增及記憶NK細(xì)胞形成障礙的原因。該研究證明，STAT4介導(dǎo)的Runx轉(zhuǎn)錄因子表觀遺傳學(xué)修飾可以調(diào)節(jié)NK細(xì)胞對病毒的適應(yīng)行為。

2 表觀遺傳學(xué)對NK細(xì)胞功能的影響

NK細(xì)胞的功能主要包括殺傷及免疫調(diào)節(jié)作用。有研究顯示，在NK細(xì)胞活化過程中，81%的主要位點出現(xiàn)CpG去甲基化，生物學(xué)分析顯示差異甲基化位點主要集中在免疫調(diào)節(jié)功能中(如TNFA、LTA、IL-13、CSF2等)[22]，這提示表觀遺傳學(xué)修飾參與了NK細(xì)胞的活化，并與NK細(xì)胞功能關(guān)系密切。

2.1表觀遺傳學(xué)修飾對NK細(xì)胞表面受體的調(diào)節(jié)作用NK細(xì)胞表面激活性受體與抑制性受體的相互平衡，在NK細(xì)胞功能中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用。如激活性受體表達(dá)占優(yōu)，則NK細(xì)胞活化，反之，NK細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。

有學(xué)者[23-25]檢測了NK細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR)啟動子的甲基化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處于靜息狀態(tài)的人NK細(xì)胞92細(xì)胞系中KIR2DL1、 KIR2DL2/L3高甲基化，同時，細(xì)胞表面的KIR表達(dá)降低。當(dāng)應(yīng)用5-氮雜胞苷進(jìn)行去甲基化處理后，KIR啟動子去甲基化，NK細(xì)胞表面KIR表達(dá)明顯增加。另外，KIR的表達(dá)受miRNA調(diào)節(jié)。PIWI樣RNA可以誘導(dǎo)KIR雙向啟動子KIR3DL1產(chǎn)生KIR反義轉(zhuǎn)錄本，影響雙鏈DNA的合成，可減少90%的KIR表達(dá)[25]。

NKG2D是NK細(xì)胞激活性受體，其表達(dá)增加可增強(qiáng)NK細(xì)胞功能。NKG2D通過識別不同的配體家族(MICA、MICB、ULBPs 1-6等)參與激活效應(yīng)細(xì)胞、溶解靶細(xì)胞。NKG2D基因在NKG2D+NK細(xì)胞中去甲基化，并與組蛋白H3賴氨酸9乙?；?H3K9Ac)相關(guān)。用組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)抑制劑(姜黃素)可以明顯下調(diào)NKG2D基因H3K9乙酰化水平，進(jìn)而下調(diào)NKG2D的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致NKG2D表達(dá)減低，NK細(xì)胞殺傷功能下降。此研究提示NKG2D在NK細(xì)胞表面表達(dá)差異是由表觀遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)節(jié)的，并可以通過表觀遺傳治療改善[26]。組蛋白去乙?；敢种苿┍焖?VPA)通過激活基因啟動子中組蛋白K9的高甲基化和DNA甲基化，從而下調(diào)NKG2D的表達(dá)[27]。同樣，miRNA也可發(fā)揮對NKG2D的調(diào)節(jié)作用。在HCV感染患者的NK細(xì)胞中，miR-182與對照組相比過表達(dá)，miR-182表達(dá)升高可降低NKG2D的mRNA水平，而miR-182抑制劑能降低抑制性受體NKG2A的mRNA水平[28]。

2.2表觀遺傳學(xué)修飾對NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌水平的調(diào)節(jié)作用NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子同樣受到表觀遺傳學(xué)修飾的調(diào)節(jié)。Luetke-Eversloh等[29]報道，NK細(xì)胞受到刺激后，IFN-γ及T-bet位點轉(zhuǎn)錄增加，并發(fā)生去甲基化，從而增加IFN-γ的分泌。Li等[30]發(fā)現(xiàn)，在NK細(xì)胞激活過程中，組蛋白去甲基化酶及甲基轉(zhuǎn)移酶發(fā)生明顯變化。在NK92細(xì)胞系中，與NK細(xì)胞激活密切相關(guān)的PI3KCA,、NFATC1及TNFSF9等基因，經(jīng)PMA和依諾霉素刺激可出現(xiàn)H3K4me3和H3K27甲基化修飾，從而調(diào)控上述基因表達(dá)。采用H3K4和H3K37的特異性抑制劑可以增加NK細(xì)胞脫顆粒及IFN-γ 、TNF-α的分泌[22,30]。Cribbs等[31]用染色質(zhì)甲基化及乙?；男》肿右种苿┻M(jìn)行篩選，并通過基因敲除方法確定了Jumonli型組蛋白H3K27脫甲基酶是NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。JMJD3/UTX(含有Jumonji結(jié)構(gòu)域的蛋白3)H3K27去甲基化酶抑制劑GSK-J4可引發(fā)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄起始位點H3K27甲基化，并造成NK細(xì)胞IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-10分泌下降。GSK-J4可以明顯抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血或組織中分離出的NK細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌，抑制破骨細(xì)胞形成及骨破壞。除甲基化外，組蛋白乙?；揎椧矊K細(xì)胞細(xì)胞因子分泌起調(diào)節(jié)作用。VPA可抑制NK細(xì)胞對白血病細(xì)胞的溶解，并且有劑量依賴性。VPA預(yù)處理可降低NK細(xì)胞IFN-γ分泌，破壞CD107A脫顆粒，并通過激活PD-1/PD-L1途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]。

H3K4me3脫甲基酶KDM5A調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄并參與腫瘤的發(fā)生。Zhao等[32]研究證明KDM5A缺陷使IFN-γ產(chǎn)生減少，并損害NK細(xì)胞的活化。KDM5A(-/-)小鼠對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(LM)感染高度敏感。在NK細(xì)胞活化過程中，KDM5A的缺失影響STAT4磷酸化和核定位，并增加了細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(SOCS1)的表達(dá)。進(jìn)一步研究揭示其機(jī)制為KDM5A與P50結(jié)合，并與靜止NK細(xì)胞中的SOCS1啟動子區(qū)結(jié)合，抑制染色質(zhì)重塑，導(dǎo)致在SOCS1啟動子中H3K4me3修飾顯著減少。

另外，Lee等[19]在研究記憶性NK細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，人巨細(xì)胞病毒感染后，NK細(xì)胞Syk轉(zhuǎn)錄起始位點甲基化，Syk基因沉默，可引起表達(dá)IFN-γ水平升高。BHLHE40為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在活化的NK細(xì)胞中去甲基化，誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌(如IL-2、IL-12、IL-15、IFN、TNFA等)，增強(qiáng)NK細(xì)胞功能。NFAT轉(zhuǎn)錄因子家族通過與啟動子及增強(qiáng)子區(qū)域結(jié)合來增加NK細(xì)胞因子的表達(dá)。在活化的NK細(xì)胞中，NFATC1內(nèi)含子9 明顯去甲基化，可調(diào)節(jié)NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子[22]。

3 引起NK細(xì)胞表觀遺傳學(xué)變化的因素

多種疾病狀態(tài)下，NK細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)修飾會發(fā)生變化，如巨細(xì)胞病毒感染會激活NK細(xì)胞，引起81%的位點發(fā)生DNA去甲基化[22]。在兒童哮喘患者中，NK細(xì)胞DNA去甲基化，引起NK細(xì)胞活性升高[33]。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及強(qiáng)制性脊柱炎中，NK細(xì)胞均存在表觀遺傳學(xué)改變[31-34]。

一些藥物可以引起NK細(xì)胞的表觀遺傳修飾變化。Misale等[35]報道，糖皮質(zhì)激素可以通過影響H3K27me3來降低IFN-γ的表達(dá)，從而抑制NK細(xì)胞的免疫功能。5-氮雜胞苷可引起NK細(xì)胞DNA去甲基化，誘導(dǎo)相關(guān)基因激活，促進(jìn)NK細(xì)胞活化[36]。

運(yùn)動也可以引起NK細(xì)胞表觀遺傳學(xué)修飾發(fā)生改變。Zimmer等[37]選取30例非霍奇金淋巴瘤患者及10名健康人，干預(yù)組每人每天騎車運(yùn)動30 min。運(yùn)動組的患者血清巨噬細(xì)胞游走抑制因子(MIF)及IL-6水平升高，NK細(xì)胞組蛋白H3、H4乙?；浇档汀＝?，研究者再次證明運(yùn)動可以通過升高組蛋白乙?；郊癗KG2D的表達(dá)，改善正常人NK細(xì)胞活化狀態(tài)[38]。

壓力及年齡的增長對NK細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)也有明顯影響。創(chuàng)傷后應(yīng)激綜合征可以加速NK細(xì)胞由年齡造成的甲基化水平升高，從而影響機(jī)體免疫狀態(tài)[39]。

綜上所述，表觀遺傳學(xué)修飾影響著NK細(xì)胞的增殖、分化、殺傷、免疫調(diào)節(jié)等，在NK細(xì)胞調(diào)控中，扮演重要角色。但目前，NK細(xì)胞表觀遺傳學(xué)研究多集中在基礎(chǔ)實驗階段，在臨床疾病中的應(yīng)用很少。NK細(xì)胞參與腫瘤、自身免疫疾病及感染的發(fā)病，其異常是否與表觀遺傳學(xué)修飾有關(guān)？進(jìn)一步研究NK細(xì)胞表觀遺傳學(xué)異常在疾病發(fā)生中的作用，將基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化，開拓疾病中NK細(xì)胞功能異常的新思路，并為新型藥物在臨床中的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)，將是本課題組今后努力的方向。