安鋼力

蘇州大學(xué)唐仲英血液學(xué)研究中心 江蘇蘇州 215123

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechain reaction PCR）技術(shù)是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的一項基因檢測即一種體外核酸擴增技術(shù)。它具有許多優(yōu)點：特異性、易重復(fù)、高效性等，可以在幾個小時完成過去幾天或者更長時間完成的實驗，因此這項技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有劃時代的意義。但是，傳統(tǒng)PCR技術(shù)有它的缺點，它通過電泳對擴增反應(yīng)的最終產(chǎn)物進行定性分析而不能對起始模板準(zhǔn)確定量，同時也無法對擴增反應(yīng)實時檢測且在實驗過程中易污染而出現(xiàn)假陽性。人們?yōu)榱藢ふ腋鼮殪`敏、快速、簡便、高特異性的方法進行了許多探索研究，直到1996 年由美國Applied Biosystems 公司推出了一種新的定量試驗技術(shù)—熒光定量PCR（Flurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction，F(xiàn)Q-PCR；real-time quantitative PCR, RT-qPCR or qPCR），它是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，標(biāo)記跟蹤PCR產(chǎn)物進行實時監(jiān)測反應(yīng)，利用與之相適應(yīng)的軟件對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度，實現(xiàn)了PCR從定性到定量質(zhì)的跨越，具有里程碑意義。目前，此項技術(shù)已應(yīng)用于干細(xì)胞研究、腫瘤學(xué)和遺傳疾病研究、病原體檢測和傳染病研究、藥物分析、藥物基因組學(xué)、植物學(xué)研究和農(nóng)業(yè)生物科技等多領(lǐng)域研究中[1]。本文對實時熒光定量PCR的原理、分類和應(yīng)用進行闡述。

1 實時熒光定量PCR技術(shù)的原理

real-time quantitative PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，通過熒光信號不斷累積而實現(xiàn)實時監(jiān)測PCR全程，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。在熒光定量PCR技術(shù)中有2個概念比較重要。（1）熒光域值（threshold）的設(shè)定：PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。（2）Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)[2]。在實時熒光定量PCR中，對全程PCR擴增過程進行實時檢測，根據(jù)反應(yīng)時間和熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。一般來說，整條曲線可以分3個階段：熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期[3]。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號與背景無法區(qū)分，無法判斷產(chǎn)物量的變化。在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，所以反應(yīng)終產(chǎn)物量與起始模板量之間已經(jīng)不存在線性關(guān)系，通過反應(yīng)終產(chǎn)物也算不出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光產(chǎn)生進入指數(shù)期，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，所以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點上來檢測PCR產(chǎn)物的量，由此來推斷模板最初的含量而進行定量分析。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小[4,5]。通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

2 實時熒光定量PCR技術(shù)熒光化學(xué)分類和定量方法

2.1 實時熒光定量PCR常用的熒光化學(xué)分類

實時熒光定量常用的熒光化學(xué)分類有SYBR Green I法和Tag Man探針法。SYBR Green I是一種具有綠色激發(fā)波長的染料，最大吸收波長約為497 nm，發(fā)射波長最大約為520 nm，可以和所有的dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域結(jié)合。因為在游離狀態(tài)下SYBR Green I發(fā)出的熒光較弱，但是當(dāng)它與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光就會大大增強，而且熒光信號的增加與PCR 產(chǎn)物的增加完全同步。此法的優(yōu)點是它可以監(jiān)測任何dsDNA序列的擴增，檢測方法較為簡單，成本較低，但也正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，如非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體也能與染料結(jié)合而產(chǎn)生熒光信號，使實驗產(chǎn)生假陽性結(jié)果，因此其特異性不如探針法[6]。因為非特異性產(chǎn)物和引物二聚體的變性溫度要比目標(biāo)產(chǎn)物的低，所以可以在熔解曲線（melting curve）反應(yīng)過程中利用軟件分析儀器收集到信號進行鑒別。

TaqMan探針法是具有高度特異性的定量PCR技術(shù)。它的工作原理是在PCR反應(yīng)體系中存在一對PCR引物和一條探針，探針的5′端標(biāo)記有報告基團，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團，探針只與模板特異結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。當(dāng)探針完整的時候，報告基團的熒光能量被淬滅基團吸收，所以儀器搜集不到信號，隨著反應(yīng)的進展，Taq酶遇到探針，利用3′→5′外切核酸酶的活性把探針切斷，導(dǎo)致報告基團的熒光能量不能被淬滅基團吸收，產(chǎn)生了熒光信號，因此信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。

2.2 實時熒光定量PCR技術(shù)定量方法

在實時熒光定量PCR中模板定量有兩種：絕對定量和相對定量。絕對定量指的是用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算未知的樣本的量。絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品一般是指含有和待測樣品相同擴增片段的克隆質(zhì)粒、含有和待測樣品相同擴增片段的cDNA，PCR的產(chǎn)物，把它們分別稀釋為不同的濃度作為模板進行反應(yīng)。橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值，縱坐標(biāo)為得到的CT值，可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知樣本的CT值，可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到樣本的拷貝數(shù)進而對未知樣本進行定量。相對定量是在一定樣本中靶序列相對于另一參照樣本的量的變化，也就是比較經(jīng)過處理的樣本和未經(jīng)處理的樣本之間的相對基因表達(dá)差異。常用方法有標(biāo)準(zhǔn)曲線法和2－△△CT法，后者是分析基因表達(dá)相對變化的一種簡便方法。

3 實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

實時熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性高和精確性高的優(yōu)點，此項技術(shù)已被應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品檢測和環(huán)境監(jiān)測等多個領(lǐng)域。

3.1 在分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究應(yīng)用

3.1.1 定量核酸濃度

傳統(tǒng)方法是用瓊脂糖凝膠電泳或者分光光度計測定核酸濃度，其結(jié)果不準(zhǔn)確而且易污染，實時熒光定量PCR可以解決這些問題，它準(zhǔn)確性、靈敏度高且無污染，對一些傳染性疾病進行定量分析、病原微生物和病毒含量檢測，此項技術(shù)都是首選。

3.1.2 研究基因表達(dá)

應(yīng)用實時定量PCR技術(shù)可以對基因時間、空間表達(dá)水平差異進行比較。例如，對特定基因用物理、化學(xué)、藥物等不同方法處理后的差異進行比較，為人們的科學(xué)研究提供依據(jù)。

3.1.3 用于單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測分析

人們對疾病的易感性和對同一種藥物治療同一種疾病的效果是有差異性的，遺傳物質(zhì)DNA的多態(tài)性RELP，STR，ABO血型和SNP是個體差異的遺傳基礎(chǔ)。SNP在人類基因組中廣泛存在，是人類可遺傳變異中最常見的一種，在遺傳性疾病的研究中具有重要意義。

3.1.4 DNA甲基化檢測

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)重要的標(biāo)記信息，通過實時熒光定量PCR技術(shù)獲得基因組甲基化水平數(shù)據(jù)對表觀遺傳學(xué)的時空特異性研究具有重要意義。

3.2 在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究應(yīng)用

3.2.1 用于病原體檢測

常規(guī)PCR不能定量，在操作中易污染導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性結(jié)果，應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)可以解決這些問題。目前，此項技術(shù)已應(yīng)用于檢測丙肝病毒、宮頸癌及其癌前病變有關(guān)的人類乳頭瘤病毒、抗結(jié)核藥物治療后定量檢測病人痰樣本病原體DNA含量，為疾病的診斷和治療提供依據(jù)。用此項技術(shù)還可以一次性檢測大量大腸桿菌樣本，簡便準(zhǔn)確，是食品檢測方面的一個突破。

3.2.2 腫瘤基因檢測

腫瘤發(fā)生機制非常復(fù)雜，發(fā)病機理尚未清楚，隨著基因分子水平研究不斷發(fā)展，腫瘤基因發(fā)生突變等遺傳學(xué)改變是致癌性發(fā)生的根本原因已被廣泛接受。癌基因表達(dá)異常和突變在多種腫瘤早期和良性階段就已出現(xiàn)，通過實時熒光定量PCR檢測可檢測到基因突變，準(zhǔn)確測定其表達(dá)量，為腫瘤早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療及療效和預(yù)后的判斷提供依據(jù)[7]。

3.2.3 用于藥物選擇和療效判斷

化療過程中主要問題是病人對化療藥物的耐藥，檢測腫瘤耐藥基因的表達(dá)水平是選擇化療藥物的依據(jù)。檢測微小殘留病變的變化情況對于調(diào)整治療策略和對病人進行個體化治療非常重要。

3.2.4 用于優(yōu)生優(yōu)育診斷

唐氏綜合征是由染色體異常所導(dǎo)致的，在產(chǎn)前通過實時熒光定量PCR技術(shù)做染色體核型分析，可以最大限度地防止患兒的出生，是防止此病的有效措施。此項技術(shù)還可以對孕產(chǎn)婦進行葉酸利用能力檢測，為孕產(chǎn)婦提供葉酸補充具有指導(dǎo)意義。此項技術(shù)對于降低嚴(yán)重缺陷兒出生率、提高人口素質(zhì)起到了積極的推動作用。

3.3 在食品檢測方面的應(yīng)用

食品安全是與人民群眾生活息息相關(guān)的問題。食品在生產(chǎn)、儲藏、運輸、銷售等一系列過程中不可避免地存在受到微生物污染的可能性，檢測食品中的致病菌至關(guān)重要。

例如，對2007～2008年上半年麗水地區(qū)的生畜肉、熟肉、蔬菜等172份樣本進行7個微生物項目的檢測，沙門菌的檢出率最高，生畜肉中的微生物污染最為嚴(yán)重，可以有效地提醒人們要對沙門菌污染高度重視，進而采取預(yù)防措施防控食源性疾病的發(fā)生[8]。

3.4 在環(huán)境監(jiān)測方面的應(yīng)用

實時熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)被國內(nèi)外應(yīng)用在環(huán)境監(jiān)測中，提高了監(jiān)測水平。此項技術(shù)可以檢測河流中環(huán)境微生物隨著季節(jié)變化的情況[9]。還可以用來對地表水和飲用水中致病菌進行檢測以便及時預(yù)告地表水污染情況以及采取相應(yīng)有效措施避免大范圍污染。水體中即使有少量沙門氏菌污染也會危害健康，此項技術(shù)可以幫助人們找到其污染源，便于及時安排沙門氏菌接種[10]。應(yīng)用此技術(shù)，以炭疽芽孢桿菌特異的pagA，rpoB2cap 引物探針檢測比較4種被炭疽疫苗株污染的土壤中炭疽的量，檢測出底限為2.5 萬拷貝/g土壤（pagA），這樣可以直接從環(huán)境樣品中檢測炭疽菌，對炭疽防治具有重要意義[11]。

4 結(jié)語

實時熒光定量PCR技術(shù)自問世以來，由于具有定量準(zhǔn)確、快速、特異性強、靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點而受到人們的青睞。廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)診斷、食品檢測和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域，應(yīng)用價值很高，解決了許多難題，產(chǎn)生了許多社會效益和經(jīng)濟效益。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進步，此項技術(shù)將得到更進一步的發(fā)展和完善，也必將存在更加廣闊的應(yīng)用空間。