程 亮，李泉林，陳奇?zhèn)?/p>

(1.美國印第安納大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理科；2.美國印第安納大學(xué)泌尿外科；3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧大連 116011)

在美國，膀胱癌發(fā)病率在男性惡性腫瘤中位于第4位、女性中位于第9位[1]。膀胱癌呈異質(zhì)性表現(xiàn)，但組織學(xué)上分為低級別和高級別。大約70%～75%新診斷的膀胱癌是非浸潤性的，這其中超過50%是低級別的[2]。這些腫瘤有大約34%的復(fù)發(fā)率，低于15%發(fā)展為浸潤性腫瘤[2]。這與高級別尿路上皮癌形成鮮明對比，高級別尿路上皮癌大約有70%復(fù)發(fā)，在1年后有5%患者出現(xiàn)臨床進(jìn)展。非肌層浸潤性膀胱癌的特點(diǎn)是復(fù)發(fā)率較高，5年生存率為90%。與之相反，肌層浸潤性膀胱癌超過50%患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，中位生存期為13～20月。

最近通過二代高通量基因技術(shù)，例如TCGA，已經(jīng)確認(rèn)了一些有意義的分子標(biāo)記物，包含拷貝數(shù)異常、體細(xì)胞突變，mRNA和microRNA表達(dá)、DNA甲基化、轉(zhuǎn)錄剪切位點(diǎn)異常和基因融合[3]。然而，發(fā)現(xiàn)腫瘤基因異常是通過石蠟包埋組織及新鮮冰凍組織，由于腫瘤的異質(zhì)性，因而少量組織活檢可能不能代表侵襲性最強(qiáng)的亞群。近來基于血液和體液(例如:尿液)中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞、細(xì)胞游離核苷酸(細(xì)胞游離腫瘤DNA，循環(huán)RNA和外泌體)的液體活檢備受關(guān)注。在膀胱癌患者中，腫瘤釋放循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)和細(xì)胞游離腫瘤DNA(ctDNA)入血液或者尿液[4]。CTCs是腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶進(jìn)入血液的，具有無創(chuàng)并且實(shí)時(shí)監(jiān)測腫瘤的分子變化。ctDNA是由血漿或者尿液中很小片段的DNA形成，其中包含腫瘤特異性基因序列，并且可能作為特異性標(biāo)記物[5]。從血液和尿液分離和分析腫瘤細(xì)胞以及DNA代表著一種新穎的早期無創(chuàng)診斷手段，并且能進(jìn)一步監(jiān)測復(fù)發(fā)以及對尿路上皮癌治療的敏感性反饋。

本文旨在概括和討論現(xiàn)行的液體活檢及其臨床應(yīng)用，特別是與膀胱癌分子標(biāo)記物的相關(guān)方面研究，從而創(chuàng)造膀胱癌新的診斷方式、預(yù)后評估以及個(gè)體化精準(zhǔn)治療。

1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)

CTCs是指從腫瘤原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶脫離進(jìn)入到血流中的細(xì)胞。它在正常循環(huán)細(xì)胞中含量很少，在腫瘤轉(zhuǎn)移患者中大約1×109血細(xì)胞含1個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，因而需要特異性方法去檢測[6]。檢測的第一步是分離CTCs，現(xiàn)在有很多手段，包括過濾法，免疫磁珠法以及微流控芯片法[7]。目前，臨床中分離CTCs最廣泛的方法是免疫磁珠法，通過在磁珠上加載與CTCs抗原對應(yīng)的特異性抗體來捕獲CTCs。比如在尿路上皮癌細(xì)胞中，最常用的陽性篩選CTCs的抗原是上皮細(xì)胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)，一旦被捕獲住，這些細(xì)胞將用CK、CD45和DAPI染色。其中EpCAM、CK染色陽性，CD45染色陰性考慮為CTCs[8]。

在臨床中CTCs檢測已經(jīng)在多種膀胱癌中應(yīng)用，并且與患者生存期及治療應(yīng)答相關(guān)。GAZZANIGA等[9]報(bào)道在非肌層浸潤患者中有8/44(18%)被檢測到CTCs，而這些出現(xiàn)CTCs的患者都與高分期以及原位癌有關(guān)。GALLAGHER等[10]發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移膀胱尿路上皮癌中CTCs相對數(shù)目較低，但是在有2處或者多處轉(zhuǎn)移的患者發(fā)現(xiàn)更多CTCs。ALVA等[11]證實(shí)對于進(jìn)行新輔助化療而后進(jìn)行根治性膀胱全切的患者，CTCs >10是預(yù)后不良(pT1或者更高)的指標(biāo)。然而，也有反對這些結(jié)果的研究，GUZZO等[12]證明CTC并不是膀胱外侵襲和淋巴結(jié)陽性的預(yù)測指標(biāo)。大部分相關(guān)研究的實(shí)驗(yàn)只占膀胱尿路上皮癌患者的一小部分，因而CTCs的特異性和敏感性還需要大樣本前瞻性實(shí)驗(yàn)來評估。

目前，通過單細(xì)胞高通量基因或者蛋白技術(shù)檢測CTCs理想的分子標(biāo)記物是臨床研究熱點(diǎn)。單細(xì)胞序列一般分為以下幾步：單細(xì)胞分離，核苷酸抽取和純化，序列庫準(zhǔn)備，生物信息庫分析。YANG等[13]對59個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測序，從3個(gè)膀胱癌患者中提取膀胱癌干細(xì)胞、膀胱癌非干細(xì)胞、膀胱上皮干細(xì)胞、膀胱上皮非干細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)了21個(gè)膀胱癌關(guān)鍵基因突變，包含了5個(gè)功能性通路：細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，染色體重構(gòu)，細(xì)胞分化和自我更新。單細(xì)胞序列可以應(yīng)用于區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常血細(xì)胞，并且同時(shí)能獲得腫瘤細(xì)胞的表達(dá)序列。在未來從CTCs單細(xì)胞序列中提取的分子序列能夠?qū)颊叩念A(yù)后和疾病進(jìn)展以及治療抵抗等提供信息，并且為直接靶向治療服務(wù)。

2 血漿循環(huán)細(xì)胞游離腫瘤DNA

所有的細(xì)胞，包括正常以及腫瘤細(xì)胞，都散發(fā)DNA，被稱為細(xì)胞游離DNA(cfDNA)。ctDNA是循環(huán)系統(tǒng)中腫瘤細(xì)胞散發(fā)的cfDNA。ctDNA是長度180～200堿基對的DNA片段[14]。ctDNA如何釋放入血的機(jī)制目前還不清楚，ctDNA主要來源考慮為細(xì)胞凋亡[15]。除此之外，還有活腫瘤細(xì)胞釋放入血的小泡(外泌體)，另外，巨噬細(xì)胞吞噬壞死腫瘤細(xì)胞也可以釋放ctDNA[14]。

ctDNA包含腫瘤特異性基因突變體，因而可能作為獨(dú)一無二的基因標(biāo)簽和標(biāo)記物。ctDNA相比于腫瘤活檢有很多優(yōu)勢，由于腫瘤異質(zhì)性很大，因而組織活檢只是腫瘤組織一個(gè)時(shí)間一個(gè)部位的“快照”[16]。而ctDNA很可能是來源于腫瘤所有位點(diǎn)，而且有希望更準(zhǔn)確地實(shí)時(shí)從腫瘤間以及腫瘤內(nèi)檢測患者疾病進(jìn)展。

ctDNA診斷的主要挑戰(zhàn)是從成千上萬的野生型DNA(正常)拷貝中確認(rèn)和追蹤極少量的突變DNA片段。這些困難可以通過二代測序或者應(yīng)用突變特異性聚合酶鏈反應(yīng)(digital polymerase chain reaction,dPCR)(數(shù)碼PCR)來克服。二代測序可以迅速獲得大量基因數(shù)據(jù)但是需要消耗很多時(shí)間進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[17]。而數(shù)碼PCR上千個(gè)PCR同時(shí)進(jìn)行，每個(gè)區(qū)域的評估是個(gè)體化實(shí)時(shí)進(jìn)行，但是，每個(gè)數(shù)碼PCR(dPCR)只針對于一個(gè)特異性突變，需要根據(jù)二代測序結(jié)果個(gè)體化設(shè)計(jì)。不過如果建立，相比于二代測序，個(gè)體化的dPCR序列是高特異性及敏感性、快速、經(jīng)濟(jì)的手段。

很多研究關(guān)注膀胱癌中ctDNA的應(yīng)用。BIRKENKAMP-DEMTRODER等[18]回顧性檢測了12個(gè)非肌層浸潤性患者的血清和尿液(6個(gè)復(fù)發(fā)，6個(gè)進(jìn)展)。通過二代測序檢測基因突變，將高腫瘤特異性的基因突變制成個(gè)體化適用于dPCR的序列檢測其余患者的血漿及尿液。12個(gè)患者中有10個(gè)患者檢測到ctDNA(83%)，4/6(67%)ctDNA檢查陽性的患者在幾個(gè)月后檢查臨床進(jìn)展。因而證實(shí)這個(gè)手段可以用于早期檢測及疾病預(yù)后預(yù)測。隨后，該實(shí)驗(yàn)室針對膀胱癌患者體液活檢進(jìn)行FGFR3和PIK3CA突變檢測。這些患者術(shù)前(膀胱切除術(shù))術(shù)后的樣本均被保留。8/9(89%)可以檢測到ctDNA的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，證實(shí)患者血漿中高水平ctDNA與高復(fù)發(fā)相關(guān)。與二代測序后聯(lián)合個(gè)體化序列手段相比，熱點(diǎn)突變序列更快捷和經(jīng)濟(jì)。未來臨床上需要更多大樣本的隨機(jī)對照試驗(yàn)來驗(yàn)證現(xiàn)在的發(fā)現(xiàn)[19]。

GOOTENBERG等[20]聯(lián)合Cas13a酶建立CRISPER為基礎(chǔ)的診斷系統(tǒng)，命名為SHERLOCK(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking)，這套系統(tǒng)可以在微摩水平檢測單鏈ctDNA。隨著檢測技術(shù)的增高，膀胱癌中ctDNA的應(yīng)用會越發(fā)重要。

3 尿液細(xì)胞游離腫瘤DNA

尿液同樣中也發(fā)現(xiàn)ctDNA，可能對部分膀胱癌診斷有效。膀胱癌患者尿液中主要的ctDNA主要來源于腫瘤細(xì)胞釋放，并且比血漿中濃度高，因而更容易檢測[21]。

一些研究也關(guān)注這個(gè)無創(chuàng)的基因檢測手段。KINDE等[22]通過腫瘤特異性序列TERT評估14個(gè)早期膀胱癌患者，通過TERT是否陽性預(yù)測疾病是否復(fù)發(fā)。在和組織病理相符的TERT陽性患者中，7/8(88%)患者復(fù)發(fā)，而未測到TERT的患者沒有復(fù)發(fā)。DAHMCKE等[23]檢測熱點(diǎn)突變(TERT和FGFR3)以及其余重要的甲基化基因(SALL3，ONECUT2，CCNA1，BCL2，EOMES，VIM)來驗(yàn)證針對肉眼血尿時(shí)是否能替代膀胱鏡檢查。在96/99(97%)尿路上皮癌患者中檢測到腫瘤特異性DNA，在87/376(23%)患者中沒有臨床腫瘤的證據(jù)(敏感性97%，特異性77%，陰性預(yù)測率99%，陽性預(yù)測率53%)。WARD等[24]最近研究了一種復(fù)合PCR和二代測序的技術(shù)手段，可以多種基因在一個(gè)單獨(dú)序列同時(shí)間進(jìn)行檢測。這個(gè)技術(shù)檢測323個(gè)患者6個(gè)熱點(diǎn)突變基因(FGFR3，TERT，PIK3CA，TP53，HRAS，RXRA，KDM6A)來評估其可靠性。檢測到86/122(70%)腫瘤患者以及3/109(3%)臨床沒有腫瘤的患者(10%敏感性，97%特異性)。雖然這些領(lǐng)先的研究需要對結(jié)果進(jìn)行大量的分析以及驗(yàn)證，但還是為膀胱癌尿液ctDNA檢測鋪平了前進(jìn)的道路。

尿ctDNA也用于膀胱癌預(yù)后的評估，BIRKENKAMP-DEMTRODER等[18]基于二代測序設(shè)計(jì)的個(gè)體化陣列檢測101尿液樣本。他們檢測到55/57(97%)臨床進(jìn)展的患者。反而只有22/44(50%)復(fù)發(fā)患者的尿液樣本出現(xiàn)ctDNA。另外，與復(fù)發(fā)組相比，臨床進(jìn)展組ctDNA水平更高。同時(shí)，該研究組通過dPCR檢測膀胱癌尿液樣本腫瘤特異性熱點(diǎn)FGFR3和PIK3CA突變。他們發(fā)現(xiàn)非肌層浸潤性尿液ctDNA水平很高，因而能早期檢測疾病進(jìn)展到非肌層浸潤性膀胱癌。以上結(jié)果顯示膀胱癌中尿液ctDNA比血漿更為敏感。

外泌體是(30～100 nm)細(xì)胞膜小泡，是細(xì)胞外環(huán)境中細(xì)胞外小泡的亞群[25]。有幾種方法可以檢測外泌體。比如超速離心，電子顯微鏡觀察或者特異性蛋白標(biāo)記物CD63、CD9、CD81[26]。它其中的蛋白包含核苷酸，包括DNA、mRNA、miRNA，推斷在和細(xì)胞融合時(shí)可能調(diào)節(jié)細(xì)胞活動[27]。外泌體內(nèi)容物有希望成為腫瘤標(biāo)記物。從患者身上提取外泌體可以檢測突變、剪切突變、基因融合以及基因表達(dá)序列。來源于高表達(dá)基因的mRNA可能以很高的濃度在循環(huán)中釋放外泌體。因此，外泌體的分離和分析可能比ctDNA更有優(yōu)勢。外泌體是RNA、DNA穩(wěn)定的載體，而且似乎在腫瘤患者中都呈升高趨勢[28]。

FRANZEN等[29]證實(shí)分離肌層浸潤性患者尿液的外泌體能夠誘導(dǎo)尿路上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)化，為非肌層到肌層浸潤中外泌體的作用提出新的觀點(diǎn)。BERRONDO等[30]發(fā)現(xiàn)通過EDIL3通路，高級別膀胱癌患者尿液提取的外泌體促進(jìn)尿路上皮細(xì)胞遷移和血管生成，也證明了外泌體在腫瘤進(jìn)展中的作用。

雖然是有希望的腫瘤標(biāo)記物，但是由于生物樣本的復(fù)雜性，與其余細(xì)胞外小泡并存以及缺少經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確的分離檢測手段，使得外泌體進(jìn)入臨床應(yīng)用的腳步放慢?，F(xiàn)行的外泌體分離金標(biāo)準(zhǔn)超速離心費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因而需要發(fā)展更敏感的捕獲外泌體的平臺來幫助尋找膀胱癌特異性miRNA和mRNA標(biāo)記物。

4 循環(huán)RNA

RNA包含很多種類，包括miRNA，mRNA和長鏈非編碼RNA，以上都已經(jīng)被證實(shí)可以作為膀胱癌潛在的標(biāo)記物[31]。由于對lncRNA缺少mRNA穩(wěn)定性以及相應(yīng)的深入理解，我們本文只關(guān)注循環(huán)miRNA。miRNA是18-24核苷酸長的單鏈非編碼RNA，通過抑制mRNA靶點(diǎn)而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，因而可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡以及增殖[32]。miRNA存在于血漿及尿液中，可能與核糖核蛋白復(fù)合體連接，或者在細(xì)胞外小泡中(外泌體)，以游離循環(huán)miRNA形式被檢測到。值得注意的是，體細(xì)胞DNA突變并不能代表腫瘤細(xì)胞整個(gè)分子變化，腫瘤基因表達(dá)譜的改變可能是因?yàn)閙iRNA對表觀遺傳學(xué)的影響，而這種改變ctDNA是無法檢測和分析的，因而，miRNA可以提供很有價(jià)值的信息，miRNA和實(shí)時(shí)PCR為基礎(chǔ)的技術(shù)用于研究miRNA。

miRNA在血中的組成成分似乎與腫瘤的起源相關(guān)。最近有研究顯示一些特異性的miRNA在腫瘤生成中起到重要作用，因而在未來可以被用作膀胱癌診斷、預(yù)后評估甚至治療效果評測的標(biāo)記物[32-34]。RATERT等[35]發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制子miR145在膀胱癌中最普遍下調(diào)的miR141和miR-205是膀胱癌是預(yù)后不良的標(biāo)記物。YOSHINO等[36]顯示miR-145、miR-143、miR-125b這些腫瘤抑制子在一些類型的膀胱癌中是下調(diào)的，然而促癌的miR-183、miR-96、miR-17-5p、miR-20a是上調(diào)的。ROSENBERG等[37]發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制子miR-29c表達(dá)水平在進(jìn)展性膀胱癌中嚴(yán)重下降。一半的低表達(dá)miR-29c的非肌層浸潤性膀胱癌隨后進(jìn)展為肌層浸潤性膀胱癌，然而94%高表達(dá)miR-29c的患者卻沒有進(jìn)展。SASAKI等[38]證實(shí)尿miR-146a-5p在膀胱癌患者中升高，而且濃度與腫瘤分級和浸潤深度相關(guān)。

miRNA無法在標(biāo)本中持續(xù)地存在，并且每次檢測的miRNA都不盡相同，這些缺點(diǎn)限制了miRNA在臨床上的應(yīng)用。未來仍需要多中心系統(tǒng)性的研究來確認(rèn)目前的研究結(jié)果。

5 未來展望及結(jié)論

雖然通過CTC、ctDNA、外泌體和miRNA進(jìn)行膀胱癌分子診斷迅速發(fā)展，但仍需要多中心大樣本試驗(yàn)來驗(yàn)證其臨床應(yīng)用價(jià)值。隨著新技術(shù)的不斷開發(fā)，我們相信分子診斷會廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐中，并且成為膀胱癌監(jiān)測、預(yù)后評估、治療效果評判的有力工具。