★ 鄧曉紅 黃建華 董競成

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科 上海 200040;2.復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 上海 200040)

附子，被譽(yù)為中藥“回陽救逆第一品”，是毛茛科烏頭屬植物烏頭的子根，味辛、甘，性大熱，有毒，具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、逐風(fēng)寒濕邪的功效，主治亡陽虛脫，肢冷脈微，陽萎，宮冷，心腹冷痛，虛寒吐瀉，陰寒水腫，陽虛外感，寒濕痹痛等多種疾病?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)附子成分復(fù)雜，主要成分是烏頭類生物堿、多糖、皂苷等，具有強(qiáng)心、保護(hù)心肌細(xì)胞、抗心律失常、抗炎和鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等廣泛的作用[1]。附子藥理作用的分子機(jī)制的研究，可進(jìn)一步揭示藥物作用的基礎(chǔ)，而且可以對相關(guān)基團(tuán)進(jìn)行修飾以提高藥物的治療效應(yīng)。鑒于藥物作用分子機(jī)制研究的重要性，本文檢索了PubMed數(shù)據(jù)庫中收錄的有關(guān)附子及其成分的研究文獻(xiàn)，按其作用機(jī)制的不同進(jìn)行分類，重點(diǎn)總結(jié)了附子及其有效成分藥理作用的分子機(jī)制的異同，為以后的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 β腎上腺素能受體

腎上腺素能受體(Adrenergic receptor, AR)是鳥苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白)偶聯(lián)受體的超家族成員，可分為ɑ受體和β受體兩種。目前已知的ɑ腎上腺素能受體亞型包括ɑ1和ɑ2，β腎上腺素能受體則有3個亞型，分別是β1，β2和β3受體。其中ɑ1受體主要分布在血管平滑肌，可引起血管收縮，血壓升高；ɑ2受體主要分布在去甲腎上腺素能神經(jīng)的突觸前膜，可使去甲腎上腺素分泌減少。β1受體主要分布于心血管系統(tǒng)，可引起心率增快，心肌收縮力增強(qiáng)；β2受體主要分布于支氣管平滑肌、血管平滑肌、心肌等，介導(dǎo)支氣管平滑肌松弛、血管擴(kuò)張等作用。Yang等[2]運(yùn)用虛擬篩選和雙熒光素酶報告基因檢測的方法發(fā)現(xiàn)附子中45種化合物能夠作為β2受體激動劑，其主要作用成分是烷醇胺-二萜類生物堿和單酯-二萜類生物堿。Bai等[3]通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞系CHOβ2-AR-CRE-EGFP進(jìn)一步證實去甲烏藥堿能夠激活β2受體從而松弛氣管平滑肌，并改善支氣管哮喘模型豚鼠的癥狀。Liu等[4]實驗明確了去甲烏藥堿通過β2受體而不是ɑ或者β1受體介導(dǎo)使心肌細(xì)胞增強(qiáng)K+分泌和Na+吸收，再通過Na+-Ca2+交換機(jī)制，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多，從而發(fā)揮正性肌力作用。Wu等[5]實驗亦證實去甲烏藥堿通過選擇性激活β2受體，并引起PI3K/AKT級聯(lián)反應(yīng)，從而拮抗心肌細(xì)胞凋亡和心肌梗死誘導(dǎo)的缺血再灌注損傷。但同時據(jù)報道，去甲烏藥堿也具有α1受體拮抗劑和弱的α2受體激動劑的作用[6-7]。此外，Kam SC等[8]研究發(fā)現(xiàn)，去甲烏藥堿以劑量依賴型方式誘導(dǎo)大鼠陰莖海綿體松弛，這種松弛可被β受體阻斷劑阻斷，因此去甲烏藥堿有希望作為一種通過β受體介導(dǎo)治療勃起功能障礙的先導(dǎo)化合物。Nojima H等[9]用放射性同位素檢測方法發(fā)現(xiàn)去甲烏藥堿通過β受體介導(dǎo)在小鼠運(yùn)動神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

現(xiàn)有觀點(diǎn)多認(rèn)為附子的“回陽救逆”是作為一種β受體激動劑發(fā)揮強(qiáng)心作用，但上述研究表明附子多通過激動β2受體發(fā)揮松弛平滑肌、保護(hù)心肌細(xì)胞等作用，而不是通過激動β1受體發(fā)揮強(qiáng)心作用。一種可能是附子對腎上腺素能受體作用的現(xiàn)有研究主要集中在其成分去甲烏藥堿，附子可能通過其他成分比如烏頭堿及其代謝產(chǎn)物發(fā)揮強(qiáng)心作用；另一種可能是附子通過其他途徑，比如線粒體途徑發(fā)揮“回陽救逆”的功效，這都需要進(jìn)一步研究。

2 NF-κB信號通路

核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear factor κB，NF-κB)是一類具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，廣泛存在于多種組織細(xì)胞中，參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡以及腫瘤發(fā)生等多種生物過程。NF-κB是屬于Rel家族的轉(zhuǎn)錄因子，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)哺乳動物細(xì)胞內(nèi)NF-κB家族包括5個成員，分別是p65(Rel A )，Rel B，c-Rel，p50/p105(NF-κB1)和p52/p100(NF-κB2)。細(xì)胞外的應(yīng)激因素如脂多糖、前炎性細(xì)胞因子、有絲分裂原等均可引起NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活。Zeng等[10]研究發(fā)現(xiàn)，烏頭類生物堿烏頭原堿能夠通過抑制NF-κB活化從而抑制RAW264.7細(xì)胞中由核因子κB受體活化因子配體(Receptor activator for nuclear factor-κB ligand, RANKL)誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，表明烏頭原堿可以通過下調(diào)NF-κB信號通路從而抑制破骨細(xì)胞的生成，揭示了附子治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)疾病的一種可能的機(jī)制。Kang等[11]發(fā)現(xiàn)附子成分去甲烏藥堿能夠在Raw264.7細(xì)胞中通過抑制NF-κB活化從而抑制由脂多糖和干擾素-γ誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生和iNOS表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用，并且去甲烏藥堿可能在膿毒性休克或者內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥性疾病等心肌收縮力降低的情況下更有效。在體內(nèi)實驗中，Luo等[12]發(fā)現(xiàn)附子水提物可以提高肝功能從而減輕大鼠急性肝衰竭的嚴(yán)重程度，其機(jī)制可能為下調(diào)細(xì)胞外高遷移率族蛋白1(High mobility group box-1 protein，HMGB1)從而降低Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)，最終致NF-κB下調(diào)發(fā)揮肝細(xì)胞保護(hù)作用。同時作者觀察到附子水提液可以顯著降低caspase-3 mRNA水平，而在受損組織NF-κB mRNA表達(dá)與caspase-3水平密切相關(guān)，由此推測附子水提液可能通過抑制caspase-3途徑減少了肝細(xì)胞的凋亡。

上述研究表明附子水提物對NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有抑制作用，但具體機(jī)制的研究僅處于起始階段，其上下游機(jī)制仍未明確，需進(jìn)一步研究。

3 AMPK信號通路

腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine 5-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)信號通路中，AMPK是一種異源三聚體蛋白，作為感受細(xì)胞能量的開關(guān)在細(xì)胞的代謝調(diào)控中起到十分重要的作用。AMPK的活性主要受細(xì)胞中ADP/ATP比值的調(diào)節(jié)，可以被任何造成細(xì)胞內(nèi)ATP減少的應(yīng)激刺激而激活，這些刺激包括代謝性產(chǎn)物、氧化應(yīng)激、缺氧、低糖等。mTOR是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，AMPK可通過抑制其下游信號分子mTOR調(diào)控細(xì)胞自噬[13]。Liao等[14]研究發(fā)現(xiàn)，附子多糖在H9c2心肌細(xì)胞中通過AMPK/mTOR信號通路的活化增加細(xì)胞自噬從而減輕因缺血缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡。PGC-1ɑ在線粒體生物合成和氧化代謝中發(fā)揮重要作用，研究證實AMPK活化可增加PGC-1ɑ轉(zhuǎn)錄[15]。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)，附子多糖在Schwann細(xì)胞中可通過激活A(yù)MPK-PGC-1ɑ信號通路從而減輕由高糖引起的氧化損傷，但上游具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。羥甲基戊二酸CoA(HMG-CoA)還原酶是AMPK下游的一個重要靶點(diǎn)，是調(diào)節(jié)甘油三酯合成的關(guān)鍵酶。Huang等[17]發(fā)現(xiàn)附子多糖可降低高膽固醇大鼠模型的膽固醇含量，這種作用與降低HMG-CoA還原酶的表達(dá)有關(guān)。

4 PI3K/AKT信號通路

磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol-3-kinases)/AKT信號通過廣泛存在于細(xì)胞中，參與細(xì)胞生長、增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化。PI3K由p85和p110組成，其分別具有調(diào)節(jié)和催化功能，相對分子量分別為85×103和110×103。PI3K的p110亞基與蛋白激酶具有同源性，本身具有Ser/Thr激酶的活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性。Akt又稱為蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一個重要的下游靶激酶，是PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心。PI3K激活的Akt可以通過磷酸化作用激活或抑制其下靶蛋白Bad、Caspase9、NF-κB、Forkhead、mTOR、Par-4、P21等，而介導(dǎo)多種生長因子等誘發(fā)的細(xì)胞增殖，經(jīng)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞存活。Wu等[5]研究發(fā)現(xiàn)去甲烏藥堿可以通過激活PI3K和Akt磷酸化以抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕缺血再灌注引起的心肌損傷，并且PI3K抑制劑Wortmannin可阻斷這種抗凋亡作用和Akt磷酸化。另有報道稱發(fā)現(xiàn)在低氧條件處理下的C6細(xì)胞中，去甲烏藥堿可通過激活PI3K/Akt信號通路，并引起下游轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2, Nrf-2)轉(zhuǎn)位，從而誘導(dǎo)血紅素氧合酶1(Heme Oxygenase 1, HO-1)產(chǎn)生發(fā)揮保護(hù)腦細(xì)胞作用，這種作用可被PI3K抑制劑LY 294002所阻斷[18]。Chen等[19]亦報道四逆湯主要成分去甲烏藥堿聯(lián)合6-姜辣素可通過上調(diào)PI3K/Akt抑制心肌細(xì)胞凋亡。另外，Du等[20]發(fā)現(xiàn)烏頭堿可以通過抑制PI3K/Akt通路發(fā)揮抗黑色素瘤作用。

綜上，附子成分去甲烏藥堿可激活PI3K/Akt通路，而烏頭堿則可抑制PI3K/Akt通路。附子不同成分在不同細(xì)胞中可發(fā)揮截然相反的作用，這是不是可以部分揭示臨床上“異病同治”和中藥具有雙向調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制，也是值得進(jìn)一步研究和探討的問題。同樣的，有關(guān)附子及其成分對PI3K/Akt信號通路影響的研究，也應(yīng)明確其上下游機(jī)制。

5 BDNF信號通路

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中一個很重要的分泌蛋白，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)，尤其在海馬的表達(dá)水平最高。BDNF通過與酪氨酸激酶B受體(tyrosine receptor kinase B, TrkB)結(jié)合，使酪氨酸激酶自身磷酸化，從而實現(xiàn)對細(xì)胞存活、生長、分化和突觸可塑性發(fā)揮多重調(diào)節(jié)作用。Yan等[21]研究發(fā)現(xiàn)，附子多糖可顯著升高社交失敗小鼠海馬中的BDNF從而發(fā)揮抗抑郁作用，并且TrkB抑制劑K252a可完全阻斷這種作用。在BDNF信號通路的下游，環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)是胞內(nèi)與抑郁癥相關(guān)信號通路的一個交匯點(diǎn)，能夠調(diào)節(jié)多種神經(jīng)系統(tǒng)功能。在卵巢摘除的抑郁模型雌性小鼠中，Liu等[22]發(fā)現(xiàn)附子總生物堿可上調(diào)小鼠海馬和額葉皮質(zhì)中BDNF表達(dá)和CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性，但未發(fā)現(xiàn)兩者之間的相關(guān)性。并且比較了附子總生物堿與附子多糖抗抑郁作用的不同，發(fā)現(xiàn)附子總生物堿表現(xiàn)出更快速的抗抑郁作用，而附子多糖長期抗抑郁效果更好。

6 MAPK及其他可能的分子靶標(biāo)

絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases, MAPK)信號途徑存在于所有生物體內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞中，調(diào)節(jié)不同的進(jìn)程，包括增殖、分化以及凋亡。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular regulated protein kinases, ERK1/2)是MAPK家族中的重要成員，有報道發(fā)現(xiàn)附子水提物可通過激活ERK1/2信號通路促進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖[23]。Du等[20]發(fā)現(xiàn)烏頭堿通過抑制MAPK/ERK1/2信號通路調(diào)節(jié)黑色素瘤細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原和凋亡相關(guān)蛋白及mRNA表達(dá)，從而發(fā)揮抗黑色素瘤作用。

此外，Liou等[24]發(fā)現(xiàn)附子炮制品黑順片在糖尿病大鼠模型中，可以通過激活骨骼肌和肝臟中μ阿片受體而降低血糖。Omiya等[25]發(fā)現(xiàn)附子的鎮(zhèn)痛作用可能與κ阿片受體和多巴胺受體有關(guān)。Li等[26]研究發(fā)現(xiàn)附子總生物堿能夠通過GABAA-苯二氮受體復(fù)合物發(fā)揮抗癲癇作用，降低癲癇模型小鼠的死亡率。

7 小結(jié)

附子及其成分的藥理作用涉及多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和分子靶點(diǎn)，但由于附子主要有效成分烏頭堿有毒，所以現(xiàn)有的研究多集中在烏頭堿以外的成分，并且分子機(jī)制表現(xiàn)出模型依賴、組織特異等特點(diǎn)，這些因素都增加了準(zhǔn)確描述附子藥理作用分子機(jī)制的復(fù)雜性和難度。通過梳理上述文獻(xiàn)，對今后附子藥理效應(yīng)分子機(jī)制的研究有以下幾點(diǎn)提示：①把研究目標(biāo)部分轉(zhuǎn)向附子的主要有效成分同時也是有毒成分烏頭類生物堿；②對于上述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及分子靶標(biāo)的研究，需要進(jìn)一步明確引起該通路或靶點(diǎn)變化的上游機(jī)制和發(fā)生生理效應(yīng)的下游機(jī)制；③作用靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)需進(jìn)一步明確，為新藥的開發(fā)提供基礎(chǔ)；④不同通路之間的交叉會話也是重要的研究內(nèi)容；⑤將作用靶點(diǎn)與信號通路等信息聯(lián)系起來，弄清附子發(fā)揮藥理作用的整個過程，并且對作用靶點(diǎn)、分子機(jī)制和藥理作用之間的關(guān)系做進(jìn)一步驗證；⑥尋找新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和作用靶點(diǎn)。附子在中醫(yī)臨床上具有廣泛的應(yīng)用，其成分復(fù)雜，對其藥理作用分子機(jī)制的研究或許能成為中藥現(xiàn)代化和中藥貢獻(xiàn)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的途徑之一。

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