詹振楠， 馬 青， 王文娟， 納 偉

(寧夏葡萄酒與防沙治沙職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏銀川 750001)

土壤鹽漬化是世界上最為嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題之一，預(yù)計(jì)到2050年，50%以上的耕地會(huì)發(fā)生不同程度鹽堿化，這將會(huì)嚴(yán)重影響土地利用率和農(nóng)作物產(chǎn)量[1]。中國(guó)鹽堿化土地面積已近1億hm2，潛在鹽堿地面積達(dá)1 733萬(wàn)hm2[2]，其中，東北松嫩平原、新疆維吾爾自治區(qū)、內(nèi)蒙古河套灌區(qū)、寧夏引黃灌區(qū)鹽堿化土地面積分別約為370萬(wàn)、847.6萬(wàn)、111.9萬(wàn)、46.58萬(wàn)hm2[3]，而不同地區(qū)因受自然條件及氣候差異的影響，其鹽堿地類(lèi)型較為復(fù)雜，多為復(fù)合鹽堿地，即鹽化和堿化相伴存在。鹽生環(huán)境中，種子萌發(fā)是植物生存和延續(xù)至關(guān)重要的階段[4]，更是植物能否適應(yīng)環(huán)境變化并成功建植的關(guān)鍵[5]。有研究表明，堿性鹽脅迫比中性鹽脅迫對(duì)植物的生化破壞力更強(qiáng)[6]。目前，研究NaCl、NaHCO3、Na2CO3等單一鹽或堿脅迫下植物種子萌發(fā)情況的較多，而復(fù)雜混合鹽堿對(duì)種子萌發(fā)影響的研究?jī)H在牧草、糧食等作物上[7-9]。

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr)為茄科枸杞屬多年生耐鹽、抗旱植物[10]，主要分布于我國(guó)陜西省北部、寧夏回族自治區(qū)、內(nèi)蒙古自治區(qū)、甘肅省、青海省、新疆維吾爾自治區(qū)等地[11]，成熟漿果富含紫紅色素和微量元素，是一種天然的珍稀花色苷類(lèi)色素資源，有作為藥用植物資源開(kāi)發(fā)的物質(zhì)潛力[12]。目前，有關(guān)黑果枸杞的研究報(bào)道主要集中在黑果枸杞基因與遺傳多樣性、抗氧化成分測(cè)定分析、組織培養(yǎng)快繁技術(shù)、NaCl與MgSO4單鹽脅迫下生理指標(biāo)測(cè)定及其種子萌發(fā)特性等方面[5，12-18]，而有關(guān)混合鹽堿脅迫對(duì)黑果枸杞種子萌發(fā)的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，本試驗(yàn)通過(guò)研究不同pH值條件下混合鹽堿脅迫對(duì)黑果枸杞種子萌發(fā)過(guò)程及萌發(fā)恢復(fù)的影響，以探討黑果枸杞種子萌發(fā)的耐鹽、耐堿能力及鹽堿脅迫下的生理萌發(fā)機(jī)制，以期為黑果枸杞的大面積推廣和西北地區(qū)鹽堿地、荒漠化土地的利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黑果枸杞種子，由寧夏中寧縣國(guó)家枸杞良種基地提供，該基地位于寧夏回族自治區(qū)中寧縣城東部，海拔1 170～1 180 m，地理坐標(biāo)為105°26′～106°07′ E、37°09′～37°50′ N。地域四面環(huán)山，光照充足，干旱少雨，蒸發(fā)強(qiáng)烈，有效積溫高，風(fēng)大沙多，日照時(shí)間長(zhǎng)，晝夜溫差大，是典型的溫帶大陸性季風(fēng)氣候，全年日照時(shí)數(shù)為2 800 h，年平均氣溫為9.5 ℃，無(wú)霜期159～169 d，年均降水量200 mm左右，蒸發(fā)量1 830～1 950 mm。

1.2 鹽堿脅迫條件設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選擇中性鹽NaCl、Na2SO4和堿性鹽NaHCO3、Na2CO3，以堿性鹽所占比例由小到大順序分為4個(gè)處理組，依次標(biāo)記為A、B、C、D(表1)，在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，每1個(gè)處理組設(shè)定50、100、150、200 mmol/L這4個(gè)鹽處理濃度梯度，且每個(gè)處理組采用相同測(cè)定的pH值，以蒸餾水處理為對(duì)照(CK)。采用雷磁PHS-3E型 pH計(jì)測(cè)定各溶液的pH值。

表1 各處理組NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO3配比及pH值

1.3 黑果枸杞種子萌發(fā)試驗(yàn)

試驗(yàn)于2017年11月至2018年3月在寧夏葡萄酒與防沙治沙職業(yè)技術(shù)學(xué)院植物生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，采用紙上發(fā)芽床法。挑選飽滿一致的種子，0.1%高錳酸鉀溶液殺毒30 min；蒸餾水反復(fù)沖洗5遍，晾干，備用；在直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中放入雙層濾紙，整齊擺入60粒種子，分別加入不同濃度的鹽堿溶液，直到濾紙飽和為止，以傾斜45°無(wú)明水為準(zhǔn)，每處理重復(fù)3次；加蓋，(25±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)；萌發(fā)過(guò)程中，每隔2 d更換1次相應(yīng)的鹽堿溶液，以保證溶液濃度的一致性；種子萌發(fā)以肉眼看到白色幼根為標(biāo)準(zhǔn)，每隔24 h觀察記錄萌發(fā)種子數(shù)，連續(xù)觀察13 d[14]，同時(shí)，將未萌發(fā)的種子用蒸餾水反復(fù)沖洗5～6次，轉(zhuǎn)至蒸餾水中繼續(xù)培養(yǎng)13 d，檢測(cè)種子的恢復(fù)萌發(fā)情況。統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率(GP)、發(fā)芽指數(shù)(GI)、發(fā)芽勢(shì)(GE)、相對(duì)鹽害率(Rd)、恢復(fù)萌發(fā)率，計(jì)算公式分別為：

GP=GN/SN×100%；

GI=∑(Gt/Dt)；

GE=4 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/SN×100%；

Rd=(CK處理的發(fā)芽率-鹽堿溶液處理的發(fā)芽率)/CK處理的發(fā)芽率×100%；

恢復(fù)萌發(fā)率=(a-b)/(c-d)×100%[19]。

式中，GN、SN、Gt分別為種子萌發(fā)總數(shù)、供試種子總數(shù)、當(dāng)日萌發(fā)種子數(shù)，單位為個(gè)；Dt為相應(yīng)的萌發(fā)天數(shù)，d；a、b、c、d分別為全部時(shí)間的發(fā)芽種子數(shù)、鹽堿脅迫溶液中的發(fā)芽種子數(shù)、供試種子數(shù)、復(fù)水前萌發(fā)的種子數(shù)，單位為粒。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0、Excel 2003軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和單因素方差分析，采用最小差異顯著法(LSD法)檢驗(yàn)處理間的差異顯著性，采用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合鹽堿脅迫對(duì)黑果枸杞種子萌發(fā)的影響

2.1.1 萌芽率 由圖1可見(jiàn)，4組不同濃度混合鹽堿脅迫條件下，黑果枸杞種子的萌發(fā)曲線趨勢(shì)相似，隨調(diào)查天數(shù)的延長(zhǎng)，種子萌芽率呈緩慢增加趨勢(shì)，且隨處理pH值的增加(處理A至處理D)，種子萌發(fā)率下降明顯；同一處理組條件下，隨鹽堿脅迫濃度的增加，各處理組的種子萌發(fā)率呈下降趨勢(shì)。

由表2可見(jiàn)，連續(xù)觀察13 d時(shí)，黑果枸杞種子對(duì)照組的萌發(fā)率為65.6%；脅迫處理鹽堿濃度為50 mmol/L時(shí)，各處理組黑果枸杞種子的萌發(fā)率較對(duì)照下降顯著(P<0.05)；混合鹽堿濃度為100 mmol/L時(shí)，A處理組的黑果枸杞種子的萌發(fā)率為16.1%，而其他處理組的種子萌發(fā)率相互間差異較??；脅迫處理鹽堿濃度大于100 mmol/L時(shí)，各處理組黑果枸杞種子的萌發(fā)率為5.0%～7.8%，相互間差異較小。

表2 不同鹽堿脅迫下黑果枸杞種子的萌發(fā)率

2.1.2 發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽指數(shù) 由表3可見(jiàn)，隨鹽堿脅迫濃度的增加，各處理組黑果枸杞種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)呈下降趨勢(shì)，相對(duì)鹽害率呈增加趨勢(shì)，對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用愈加明顯；對(duì)照處理的黑果枸杞種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)分別為40.6%、16.4，顯著高于各處理組不同濃度處理的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)(P<0.05)；鹽堿處理濃度從50 mmol/L增加到 200 mmol/L，A組黑果枸杞種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)分別從17.2%、7.7下降到3.9%、2.2，D組黑果枸杞種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)分別從6.1%、2.9下降到2.2%、1.4；對(duì)同一處理濃度而言，隨pH值的增加(處理A至處理D)，枸杞種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)整體呈下降趨勢(shì)，而相對(duì)鹽害率呈上升趨勢(shì)。

2.1.3 恢復(fù)萌發(fā)率與最終萌發(fā)率 試驗(yàn)結(jié)果表明，連續(xù)觀察13 d后解除脅迫，不同濃度鹽堿脅迫處理的黑果枸杞種子復(fù)水1 d均有部分種子恢復(fù)萌發(fā)。由表2可見(jiàn)，各處理的種子恢復(fù)萌發(fā)率均顯著高于CK，最終萌發(fā)率均有不同程度的增加(P<0.05)，而CK處理的黑果枸杞種子不再有新的種子萌發(fā)；隨脅迫鹽堿濃度的增加，A、B處理組的黑果枸杞種子萌發(fā)恢復(fù)率呈倒“V”形降低[20]，均在鹽堿濃度為100 mmol/L時(shí)恢復(fù)萌發(fā)率相對(duì)最高，分別為49.0%、28.0%；C、D處理組的黑果枸杞種子恢復(fù)萌發(fā)率均在鹽堿濃度為50 mmol/L時(shí)相對(duì)最低，分別為16.3%、12.8%，且100～200 mmol/L鹽堿濃度脅迫下的黑果枸杞種子恢復(fù)萌發(fā)率相互間差異不顯著(P>0.05)，高鹽堿脅迫下的種子最終萌發(fā)率差異較小：隨處理鹽堿濃度的增加，各處理組黑果枸杞種子的最終萌發(fā)率呈下降趨勢(shì)，而對(duì)同一處理濃度而言，隨pH值的增加(處理A至處理D)，黑果枸杞種子的最終萌發(fā)率也呈下降趨勢(shì)。因此，高鹽堿的環(huán)境不但破壞黑果枸杞種子的活力，還抑制黑果枸杞種子的萌發(fā)。

表3 混合鹽堿脅迫對(duì)黑果枸杞種子萌發(fā)參數(shù)的影響

2.2 鹽堿濃度、pH值及其交互作用對(duì)黑果枸杞種子萌發(fā)參數(shù)的影響

由表4可見(jiàn)，鹽堿濃度、pH值及其交互作用對(duì)黑果枸杞種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均有極顯著影響，鹽堿濃度對(duì)黑果枸杞種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)有極顯著影響(P<0.01)；pH值及鹽堿濃度與pH值交互作用對(duì)黑果枸杞種子發(fā)芽勢(shì)的影響不顯著(P>0.05)。因此，鹽堿濃度是影響黑果枸杞種子萌發(fā)的決定性主導(dǎo)因素，pH值次之。

表4 鹽堿濃度、pH值及其交互作用對(duì)黑果枸杞種子各萌發(fā)參數(shù)的影響

3 結(jié)論與討論

土壤鹽漬化已成為導(dǎo)致全球可利用耕地日益減少、限制作物產(chǎn)量和品質(zhì)提高的主要非生物逆境之一[9]，關(guān)于耐鹽植物如何適應(yīng)鹽堿逆境已成為國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家學(xué)者們研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。黑果枸杞是我國(guó)西北干旱地區(qū)特有的耐鹽、抗旱野生灌木[11]，在鹽漬化和次生鹽漬化土壤上大量分布，且抗性強(qiáng)、適應(yīng)性廣，常構(gòu)成鹽爪爪-黑果枸杞的鹽生植物群落[21]，因此，研究黑果枸杞種子的耐鹽能力及鹽堿脅迫下的變化規(guī)律具有重要的科學(xué)意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

本研究結(jié)果表明，混合鹽堿脅迫下，黑果枸杞種子的萌發(fā)受到不同程度的影響，隨鹽堿脅迫濃度的上升，黑果枸杞種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)與對(duì)照相比均有不同程度下降，這與古麗內(nèi)爾·亞森等的研究結(jié)論[22]一致。鹽堿脅迫對(duì)植物種子萌發(fā)的影響主要表現(xiàn)在種子萌發(fā)率降低、種子萌發(fā)進(jìn)程延長(zhǎng)，或者使種子失去活力[23]。本研究結(jié)果表明，黑果枸杞在蒸餾水中(對(duì)照)的萌發(fā)率相對(duì)最高，當(dāng)鹽堿濃度≥100 mmol/L、pH值>8.56時(shí)，黑果枸杞種子萌發(fā)會(huì)受到嚴(yán)重抑制，萌發(fā)率均低于10%；混合鹽堿脅迫對(duì)黑果枸杞種子萌發(fā)的抑制程度比復(fù)合中性鹽脅迫相對(duì)更為嚴(yán)重，這可能是除 Na+毒害和滲透脅迫外，高pH值也影響了細(xì)胞內(nèi)的酶活性，阻礙了種子的發(fā)芽生長(zhǎng)。王恩軍等研究表明，NaCl、Na2CO3脅迫下黑果枸杞種子萌發(fā)的極限閾值分別為300、100 mmol/L[18]；劉克彪等以不同鈉鹽溶液處理黑果枸杞種子發(fā)現(xiàn)，不同鹽分脅迫對(duì)種子萌發(fā)的影響效應(yīng)不同，相同濃度不同鈉鹽處理對(duì)黑果枸杞種子萌發(fā)造成的鹽害率為NaHCO3>NaCl>復(fù)合鹽> Na2SO4[22]。本研究中，鹽堿濃度為 50 mmol/L 時(shí)，隨著堿性鹽所占比例的增加，黑果枸杞種子萌發(fā)率下降幅度相對(duì)較大，當(dāng)鹽堿濃度達(dá)到200 mmol/L時(shí)，種子萌發(fā)率受到嚴(yán)重抑制，但隨pH值上升黑果枸杞種子萌發(fā)率差異較小。

另外，試驗(yàn)結(jié)果表明，黑果枸杞種子在解除混合鹽堿脅迫后均表現(xiàn)出一定的恢復(fù)萌發(fā)能力，低濃度NaCl、Na2SO4的混合中性鹽脅迫處理的種子其恢復(fù)萌發(fā)率相對(duì)較高，其最終萌發(fā)率和對(duì)照無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而高濃度的混合中性鹽和不同濃度的混合堿性鹽脅迫處理的黑果枸杞種子恢復(fù)萌發(fā)率相對(duì)較低，且相互間相差不大，這可能是因?yàn)槲疵劝l(fā)的種子置于蒸餾水中解除鹽堿脅迫時(shí)，其種子內(nèi)部的滲透勢(shì)相對(duì)降低，促進(jìn)種子從周?chē)h(huán)境吸收水分，進(jìn)而使種子迅速恢復(fù)萌發(fā)，但當(dāng)鹽堿濃度超出黑果枸杞種子萌發(fā)的耐受范圍，細(xì)胞內(nèi)累積大量離子，使細(xì)胞質(zhì)膜完整性遭受破壞，胞內(nèi)代謝失調(diào)，造成永久性毒害，致使種子完全喪失活力[24-25]，這與王桔紅等的研究結(jié)果[12]不同，可能是混合鹽堿脅迫對(duì)黑果枸杞種子萌發(fā)的影響比單一鹽或者混合中性鹽的脅迫更為嚴(yán)重?？傊?，混合鹽堿涉及到的脅迫因素比單一鹽要復(fù)雜，混合鹽堿脅迫不僅僅是鹽、堿2種脅迫的簡(jiǎn)單疊加，而是相互間存在一定的協(xié)同效應(yīng)[26]。