高敏敏， 稅典章， 吳 萍， 葉元土， 吳 韜， 何冬成， 陳 卓， 崔振華

(1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州 215123； 2.無(wú)錫三智生物科技有限公司，江蘇無(wú)錫 214000；3.華辰水產(chǎn)有限公司，江蘇鹽城 224000； 4.林華水產(chǎn)有限公司，江蘇鹽城 224000)

異育銀鯽鰓出血病是由鯉皰疹Ⅱ型病毒(CyHV-2)引發(fā)的一種危害非常大的流行性病毒性疾病。關(guān)于CyHV-2的傳播途徑尚不完全清楚，一種可能性是通過(guò)魚(yú)卵、受精卵到魚(yú)苗的縱向傳播途徑，另一種可能途徑是通過(guò)魚(yú)體體表黏液在魚(yú)體之間的橫向傳播途徑?？v向傳播途徑的研究需要在魚(yú)卵、受精卵中找到CyHV-2存在和傳播的路徑，而橫向傳播則需要在魚(yú)體體表黏液中找到CyHV-2存在的證據(jù)和傳播路徑。

本研究以發(fā)生異育銀鯽鰓出血病的單一池塘為研究單位，以同一池塘中的不同魚(yú)類、異育銀鯽魚(yú)體的體表黏液、魚(yú)卵巢、水體、水體中藻類等為試驗(yàn)材料，采用定量PCR方法檢測(cè)CyHV-2的特異性存在，評(píng)價(jià)在池塘環(huán)境條件下不同魚(yú)體、雌性魚(yú)體卵巢、魚(yú)體體表黏液、浮游生物中是否攜帶CyHV-2，探討CyHV-2在池塘環(huán)境中的傳播途徑、存在狀態(tài)，以期為系統(tǒng)防控異育銀鯽鰓出血病的發(fā)生和發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣池塘

選擇江蘇大豐的上海農(nóng)場(chǎng)(光明漁業(yè)公司)的8號(hào)、17號(hào)池塘和大豐葦漁場(chǎng)的9號(hào)、18號(hào)池塘(鹽城華辰水產(chǎn)科技有限公司)共4個(gè)池塘為試驗(yàn)對(duì)象，這4個(gè)池塘在2017年6月初均有疑似異育銀鯽鰓出血病發(fā)生。于2017年6月23、24日分別對(duì)這4個(gè)池塘的異育銀鯽、草魚(yú)、鰱鳙魚(yú)、野雜魚(yú)和浮游生物進(jìn)行采樣，進(jìn)行CyHV-2檢測(cè)。

1.2 魚(yú)體材料

魚(yú)種類：選擇池塘中異育銀鯽、草魚(yú)、鰱魚(yú)、鳙魚(yú)、野雜魚(yú)等種類，將魚(yú)體在冰盤(pán)上解剖，取肝、胰、脾、腎等內(nèi)臟，每尾魚(yú)的肝臟、胰臟、脾臟、腎臟混合為1個(gè)樣本，液氮速凍后帶回蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)室用于檢測(cè)CyHV-2。如果鯽魚(yú)性成熟，則采集魚(yú)卵、或精巢進(jìn)行CyHV-2檢測(cè)。鯽魚(yú)體表黏液通過(guò)刮取鯽魚(yú)體表兩側(cè)提取，液氮冷凍保存于CyHV-2檢測(cè)。

1.3 浮游生物樣本

取池塘飼料投喂區(qū)域、水面下30 cm水樣，用80目濾網(wǎng)過(guò)濾，濾渣再經(jīng)過(guò)3 000 r/min離心10 min，得沉淀物液氮速凍作為池塘浮游生物樣本用于CyHV-2檢測(cè)。

1.4 CyHV-2檢測(cè)方法

以CyHV-2病毒核心序列C-2-F1和C-2-R1為引物(C-2-F1：TGGAATCAGTTCAACGCGTCAT；C-2-R1：CGTCAGTGCCTGGCAGTAATA)，提取樣品組織的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳。電泳圖譜中239 bp片段特異性條帶即為CyHV-2病毒陽(yáng)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 上海農(nóng)場(chǎng)水產(chǎn)養(yǎng)殖四區(qū)17號(hào)池塘(NC-4-17)CyHV-2檢測(cè)結(jié)果

上海農(nóng)場(chǎng)水產(chǎn)養(yǎng)殖四區(qū)17號(hào)(編號(hào)：NC-4-17)池塘面積4 hm2，魚(yú)種放養(yǎng)模式為：體質(zhì)量131.5 g/尾的異育銀鯽 38 671尾/hm2；255 g/尾的鰱魚(yú)836尾/hm2；體質(zhì)量862 g/尾的鳙魚(yú)896尾/hm2。魚(yú)種放養(yǎng)時(shí)間為2016年2月27日。2017年6月初，異育銀鯽開(kāi)始發(fā)病，診斷為鰓出血病，于2017年6月25日采樣，異育銀鯽累計(jì)死亡約3 000尾，采樣時(shí)還有鯽魚(yú)死亡情況。以收撒網(wǎng)采集池塘中6尾異育鯽魚(yú)的肝胰脾腎混合物樣品、6尾異良銀鯽的體表黏液；1號(hào)、4號(hào)鯽魚(yú)為雌性(其余為雄性)，采集了卵巢樣品。

由圖1可知，該池塘異育銀鯽發(fā)生了典型的鰓出血病，取樣的1～6號(hào)異育銀鯽的肝、胰、脾臟和腎混合物中在239 bp出現(xiàn)明顯的條帶，顯示CyHV-2的存在，也證實(shí)了該池塘發(fā)生的疾病為異育銀鯽鰓出血病。重要的是，在其黏液中檢測(cè)到了CyHV-2，在1號(hào)、4號(hào)(其他為雄性個(gè)體)異育銀鯽魚(yú)卵中也檢測(cè)到了CyHV-2。結(jié)果表明，對(duì)于已經(jīng)發(fā)病的異育銀鯽個(gè)體，其體表黏液含有CyHV-2，可以成為橫向(魚(yú)體個(gè)體之間)傳播的基礎(chǔ)，即魚(yú)體之間通過(guò)身體黏液的接觸傳播CyHV-2是可能的。同時(shí)，魚(yú)卵中CyHV-2的存在，也預(yù)示著通過(guò)魚(yú)卵傳遞到受精卵中的可能性。

2.2 上海農(nóng)場(chǎng)水產(chǎn)養(yǎng)殖一區(qū)8號(hào)池塘(NC-1-8)CyHV-2檢測(cè)結(jié)果

NC-1-8池塘是1個(gè)異育銀鯽鰓出血病發(fā)病池塘，在取樣1～6號(hào)異育銀鯽肝、胰、脾、腎的混合樣品中，在239 bp出現(xiàn)明顯的條帶，顯示CyHV-2的存在；同時(shí)，1～6號(hào)鯽魚(yú)體表黏液中也檢測(cè)到了CyHV-2的存在。在2、6號(hào)鯽魚(yú)魚(yú)卵中也檢測(cè)到CyHV-2的存在。結(jié)果表明，NC-1-8池塘的異育銀鯽發(fā)生了CyHV-2病，鯽魚(yú)肝、胰、脾、腎混合樣品中檢測(cè)到了CyHV-2；同時(shí)，鯽魚(yú)體表黏液中CyHV-2的存在，預(yù)示著魚(yú)體之間橫向傳播CyHV-2的可能性；魚(yú)卵中 CyHV-2 的存在預(yù)示著通過(guò)受精卵縱向傳播CyHV-2的可能性。

2.3 大豐葦漁場(chǎng)18號(hào)池塘(DFW-18)CyHV-2檢測(cè)結(jié)果

該池塘面積5.2 hm2，魚(yú)種放養(yǎng)模式為：異育銀鯽：體質(zhì)量 8 g/尾 的魚(yú)種20 507尾/hm2、體質(zhì)量161 g/尾的魚(yú)種 7 463尾/hm2；體質(zhì)量7 g/尾的草魚(yú)149 254尾/hm2；體質(zhì)量 13 g/尾 的鰱魚(yú)597尾/hm2；體質(zhì)量18 g/尾的鳙魚(yú) 1 239尾/hm2。魚(yú)種放養(yǎng)時(shí)間為2017年3月10日，2017年6月初異育銀鯽開(kāi)始有少量死亡，于2017年6月24日采樣，異育銀鯽累計(jì)死亡1 000尾。采樣時(shí)該池塘發(fā)病得到有效控制，沒(méi)有再出現(xiàn)鯽魚(yú)死亡情況。采集了10尾鯽魚(yú)的肝脾腎混合物樣和體表黏液；同時(shí)采集有草魚(yú)、鰱魚(yú)、鳙魚(yú)、野雜魚(yú)的肝脾腎混合樣；采集浮游生物樣品1個(gè)。

DFW-18池塘不同魚(yú)種、浮游生物中CyHV-2的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。

由圖3可知，DFW-18池塘中，異育銀鯽1、2、3、4、5號(hào)個(gè)體帶有239 bp的CyHV-2條帶，其他個(gè)體的不明顯；1、4、5、6、7、8、10號(hào)鯽魚(yú)的體表黏液有239 bp的CyHV-2條帶但不明顯。DFW-18池塘的異育銀鯽內(nèi)臟中有CyHV-2的存在，但239 bp條帶的明亮程度不強(qiáng)；異育銀鯽的體表黏液中也有CyHV-2的存在。

由圖4可知，異育銀鯽的卵巢、精巢中沒(méi)有檢測(cè)到明顯的239 bp的CyHV-2特異條帶。鰱魚(yú)2號(hào)肝脾腎混合樣中檢測(cè)到239 bp的CyHV-2條帶，而草魚(yú)、鳙魚(yú)和野雜魚(yú)中沒(méi)有檢測(cè)到239bp的CyHV-2條帶；浮游生物樣中也沒(méi)有檢測(cè)到239 bp的CyHV-2條帶。這個(gè)結(jié)果表明，在DFW-18池塘中，除了異育銀鯽內(nèi)臟和黏液中攜帶239 bp的 CyHV-2條帶外，鰱魚(yú)的個(gè)體可能有239 bp的CyHV-2條帶，而其他魚(yú)種沒(méi)有239 bp的CyHV-2條帶。

2.4 大豐葦漁場(chǎng)9號(hào)池塘(DFW-9)CyHV-2檢測(cè)結(jié)果

該池塘面積9.2 hm2，魚(yú)種放養(yǎng)模式為：體質(zhì)量76 g/尾的異育銀鯽12 716尾/hm2；體質(zhì)量63 g/尾的草魚(yú) 37 313尾/hm2；體質(zhì)量455 g/尾的鰱魚(yú)776尾/hm2；體質(zhì)量556 g/尾的鳙魚(yú)761尾/hm2。魚(yú)種放養(yǎng)時(shí)間為2017年3月6日，2017年6月初異育銀鯽開(kāi)始有少量死亡，于2017年6月24日采樣，鯽魚(yú)累計(jì)死亡1 500尾，采樣時(shí)不再有鯽魚(yú)死亡情況。采集了10尾異育鯽魚(yú)的肝脾腎混合物樣、體表黏液和卵巢樣品；同時(shí)采集浮游生物樣品1個(gè)。

由圖5可知，DFW-9池塘的異育銀鯽檢測(cè)樣本中，4、9、10號(hào)鯽魚(yú)的肝脾腎混合樣中有明顯的239 bp的CyHV-2條帶，其他個(gè)體不明顯；而1～10號(hào)鯽魚(yú)的體表黏液中均有較為明顯的239 bp CyHV-2條帶。這一結(jié)果再一次證實(shí)了異育銀鯽體表黏液有CyHV-2的存在。

由圖6可知，在內(nèi)臟和體表黏液中有CyHV-2存在的情況下，異育銀鯽卵巢中沒(méi)有檢測(cè)到CyHV-2。池塘浮游生物中也沒(méi)有檢測(cè)到CyHV-2的存在。

3 討論

筆者所在課題組前期的研究結(jié)果表明，在發(fā)生鰓出血病的異育銀鯽體內(nèi)存在大量的CyHV-2粒子，在血液、肝、胰、腎、脾臟等組織中均有CyHV-2粒子的存在，也觀察到了CyHV-2粒子的成熟過(guò)程[1-3]。這些研究結(jié)果表明，CyHV-2是鯽魚(yú)鰓出血病的病原體，CyHV-2的增殖導(dǎo)致細(xì)胞破裂、死亡，魚(yú)體體內(nèi)、尤其是鰓小片大量出血，魚(yú)體發(fā)生過(guò)度的炎癥反應(yīng)。

本研究以4個(gè)發(fā)生異育銀鯽鰓出血病的池塘為研究對(duì)象，對(duì)池塘中魚(yú)體內(nèi)臟、卵巢、黏液中CyHV-2的檢測(cè)結(jié)果顯示，在異育銀鯽發(fā)生CyHV-2病后，其肝臟、胰臟、脾臟、腎臟等內(nèi)臟器官組織中有CyHV-2的存在，也證實(shí)了這些池塘發(fā)生鯽魚(yú)死亡的疾病為CyHV-2病。

在4個(gè)目標(biāo)池塘中異育銀鯽體表黏液中CyHV-2的檢測(cè)結(jié)果顯示，鯽魚(yú)體表黏液中有CyHV-2的存在。這個(gè)結(jié)果表明，如果在體表黏液中含有CyHV-2，魚(yú)體之間通過(guò)身體的接觸，例如在攝食飼料的過(guò)程中，存在通過(guò)體表黏液傳播CyHV-2的可能性。當(dāng)然，本試驗(yàn)僅證實(shí)發(fā)病鯽魚(yú)體表黏液中CyHV-2的存在，還不能完全證實(shí)通過(guò)體表黏液傳播CyHV-2的路徑、發(fā)生過(guò)程。

異育銀鯽魚(yú)卵中CyHV-2的存在，也證實(shí)了通過(guò)魚(yú)卵、受精卵傳播CyHV-2到魚(yú)苗的可能性。當(dāng)然，本研究結(jié)果僅是證實(shí)魚(yú)卵中CyHV-2存在的客觀性，這需要有更為精確的試驗(yàn)來(lái)證實(shí)這種縱向傳播CyHV-2的路徑。

在鯽魚(yú)以外的其他種類中，僅有DFW-9池塘中鰱魚(yú)內(nèi)臟中檢測(cè)到了CyHV-2存在，而在其他種類如草魚(yú)、鳙魚(yú)和野雜魚(yú)中沒(méi)有檢測(cè)到CyHV-2。這提示通過(guò)其他種類傳播CyHV-2的可能性。

對(duì)2個(gè)池塘的浮游生物進(jìn)行了CyHV-2檢測(cè)，均未檢測(cè)

到CyHV-2的存在，顯示通過(guò)浮游生物傳播CyHV-2的途徑可能是不存在的。

綜合本試驗(yàn)結(jié)果表明，CyHV-2的傳播途徑主要還是通過(guò)鯽魚(yú)的體表黏液進(jìn)行魚(yú)體之間進(jìn)行橫向傳播、通過(guò)魚(yú)卵進(jìn)行縱向傳播的可能性，這應(yīng)該是CyHV-2在池塘中傳播的主要途徑。需要注意的是，本試驗(yàn)結(jié)果僅表明這2種傳播途徑的可能性，還需更為精確的試驗(yàn)來(lái)證實(shí)其具體的傳播路徑。