朱 波， 齊 川， 斯金平， 吳令上

(1.麗水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江麗水 323000； 2.浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江臨安 311300；3.麗水市中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，浙江麗水 323000)

鐵皮石斛(Dendrobiumcatenatum)是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有益胃生津、滋陰清熱等功效，用于熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足、食少干嘔等癥，位列中華九大仙草之首[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鐵皮石斛含有多種藥效成分，具有提高免疫力、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、抑制心血管與胃腸道疾病及止痛退熱等作用[3-7]。植物內(nèi)生真菌(endophytic fungus)是指存在于健康植物根莖葉等組織內(nèi)部，不會(huì)對(duì)宿主植物造成明顯傷害或者引起宿主植物組織明顯病癥的真菌[8]。真菌誘導(dǎo)子是來源于真菌的一種特定化學(xué)信號(hào)，在植物與真菌的相互作用中，能引起植物細(xì)胞合成積累次生代謝物，對(duì)植物具有專一性，它們主要是真菌的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)或分泌物，可以是真菌菌絲體、滅活菌絲體、發(fā)酵液和分泌物等[9]。

目前，已有多名學(xué)者將從鐵皮石斛中分離得到的內(nèi)生真菌制備成誘導(dǎo)子，探討誘導(dǎo)子對(duì)宿主生長與成分代謝的影響。陳曉梅等將從鐵皮石斛中分離的小菇屬(Mycenasp.)真菌MF24液體發(fā)酵制備成誘導(dǎo)子，與宿主原球莖共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)真菌誘導(dǎo)子在早期可抑制原球莖生長，在后期可促進(jìn)原球莖生長，并能促進(jìn)原球莖中某些化學(xué)成分的產(chǎn)生或特異性積累，特別是對(duì)生物堿類成分尤為敏感[10-11]。宋經(jīng)元等研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子可提高宿主原球莖多糖含量[12-13]。潘超美等研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)子對(duì)鐵皮石斛的愈傷組織、擬原球莖及不定芽均有不同程度的促生長作用，某些特定誘導(dǎo)子對(duì)根的分化有抑制作用[14]。侯丕勇等發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)子可促進(jìn)原球莖苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)和脂肪氧化酶(LOX)活性的升高[15]。但是，研究誘導(dǎo)子對(duì)宿主組培苗生長與代謝成分影響的報(bào)道尚不多見。前期研究顯示，鐵皮石斛內(nèi)生真菌DO14[擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsissp.)]、DO18[藍(lán)狀菌屬(Talaromycessp.)]、DO19[炭角菌科(Xylariaceae sp.)]、DO120[炭團(tuán)菌屬(Hypoxylonsp.)]可顯著促進(jìn)宿主生長與有效成分代謝[16]。為了探討內(nèi)生真菌起活性作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究將上述優(yōu)良菌株制備成相應(yīng)誘導(dǎo)子，并進(jìn)行誘導(dǎo)子可溶性糖含量測(cè)定，為內(nèi)生真菌資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試內(nèi)生真菌DO14、DO18、DO19、DO120與鐵皮石斛組培苗均由浙江農(nóng)林大學(xué)省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，詳見表1。

主要儀器：HVA-85全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋(日本三洋電機(jī)株式會(huì)社)；SW-CJ-1C型雙人單面超凈工作臺(tái)(上?？德穬x器設(shè)備有限公司)；JZ-100-B型接種器具殺菌器(上海稼豐園藝用品有限公司)；Milli-Q Academic超純水儀(美國Millipore公司)；UV2550紫外-可見分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；KQ5200DE型數(shù)控超聲清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)；MJP-250S型霉菌培養(yǎng)箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；DGG-9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；FA1004B型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；HYG-A全溫?fù)u瓶柜(江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。蒽酮乙酸乙酯試劑，取1 g分析純蒽酮(批號(hào)：30015014，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)溶于50 mL乙酸乙酯中，置于棕色瓶中保存；蔗糖(批號(hào)：40159760)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸(批號(hào)：81007)購自深圳市冠泰化工有限公司；水為超純水；其他試劑為分析純。

表1 供試內(nèi)生真菌

1.2 內(nèi)生真菌的固體培養(yǎng)與液體發(fā)酵

將目標(biāo)菌株從試管斜面挑出，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(含有200 g/L馬鈴薯、20 g/L葡萄糖、15 g/L瓊脂，pH值自然)上培養(yǎng)，待菌絲長滿平板后，用真菌打孔器打成小菌塊(5 mm×5 mm)，接種至馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)培養(yǎng)基(含有200 g/L馬鈴薯、20 g/L葡萄糖，pH值自然)中進(jìn)行發(fā)酵，每瓶接種10個(gè)菌塊，在 180 r/min、25 ℃條件下培養(yǎng)至一定階段，定期觀察菌液形態(tài)與顏色變化。

1.3 菌絲提取物(extract of mycelium，簡(jiǎn)稱EM)誘導(dǎo)子的制備與可溶性糖含量的測(cè)定

將菌絲液體發(fā)酵液于121 ℃高溫滅菌20 min，用4層紗布過濾，收集菌絲，用無菌水洗滌3～5次，再用勻漿機(jī)打碎過濾，最后用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，即為EN誘導(dǎo)子溶液。將懸浮培養(yǎng)0、4、8、12、16、20 d的誘導(dǎo)子溶液，用蒽酮比色法[17]測(cè)定溶液中的可溶性糖含量，測(cè)定波長為620 nm，可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=8.717 1x+0.014 7，其中y代表D620 nm，x代表濃度，r2=0.999 8，線性范圍為0.005～0.05 mg/mL，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 乙醇沉淀、上層清液、蛋白-多溏部位誘導(dǎo)子的制備

按照?qǐng)D1方法分離EM誘導(dǎo)子化學(xué)部位，將誘導(dǎo)子溶液于 80 ℃ 減壓濃縮至一定體積，按體積比1 ∶4加入95%乙醇，于25 ℃沉淀2 d，8 000 r/min離心5 min，收集醇沉物，減壓凍干得乙醇沉淀(ethanol sediment，簡(jiǎn)稱ES)粉末，上清液減壓凍干得上層清液(supernatant liquor，簡(jiǎn)稱SL)粉末；將醇沉物ES溶于少量蒸餾水，加適當(dāng)體積Sevage試劑(三氯甲烷、正丁醇的體積比=5 ∶1)除蛋白，4 000 r/min離心5 min，取上清，通過截留分子量為2 ku的再生纖維素透析袋(長38 mm)用自來水透析48 h，用蒸餾水透析12 h，最后將透析袋內(nèi)液體濃縮減壓凍干得蛋白-多糖部位(protein polysaccharides fraction，簡(jiǎn)稱PPF)粉末，主要包括多糖和與多糖結(jié)合的蛋白等成分[18]，分別計(jì)算DO14、DO18、DO19與DO120各誘導(dǎo)子得率，公式如下：各誘導(dǎo)子得率=誘導(dǎo)子粉末質(zhì)量/總菌絲質(zhì)量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)子培養(yǎng)液形態(tài)觀察

將DO14、DO18、DO19與DO120菌株從PDA培養(yǎng)基轉(zhuǎn)至PDB液體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)后，菌絲塊形態(tài)與培養(yǎng)液顏色發(fā)生變化。DO14培養(yǎng)液為乳黃色，培養(yǎng)前期，菌絲塊周圍長出刺狀物，培養(yǎng)4 d時(shí)，菌絲塊與培養(yǎng)液呈混合凝膠狀，黏稠度較高，已無法分離菌塊，過濾較困難；DO18培養(yǎng)液為暗紅色，菌液較澄清，前期菌絲塊較集中，后期菌絲塊分散，容易過濾；DO19培養(yǎng)液為黑褐色，前期菌絲塊為黃色，培養(yǎng)1周后菌絲塊分散消失，肉眼不可見，菌液較渾濁，呈膠狀，黏稠度中等；DO120培養(yǎng)液為淡黃色，前期菌塊呈不規(guī)則形的較大顆粒狀，培養(yǎng)4 d時(shí)菌絲塊分散為細(xì)小顆粒，沉淀在底部，菌液澄清，過濾較容易。誘導(dǎo)子培養(yǎng)液形態(tài)觀察有助于掌握菌絲生長動(dòng)態(tài)，便于后期誘導(dǎo)子菌絲的收集。

2.2 誘導(dǎo)子溶液可溶性糖含量動(dòng)態(tài)變化

由圖2可見，DO14、DO18、DO19與DO120 EM誘導(dǎo)子溶液的可溶性糖含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而發(fā)生變化，在20 d培養(yǎng)期內(nèi)，以上4種供試菌株在培養(yǎng)4 d時(shí)可溶性糖含量最高，分別達(dá)到1.530、3.484、1.188、3.015 mg/mL，而后呈下降趨勢(shì)，其中培養(yǎng)4～8 d的區(qū)間下降趨勢(shì)最明顯，培養(yǎng)后期變化趨于平緩。從誘導(dǎo)子溶液可溶性糖含量看，培養(yǎng)4 d為目標(biāo)菌株最佳培養(yǎng)時(shí)間。

2.3 ES、SL與PPF誘導(dǎo)子得率比較

由表2可知，不同菌株ES、SL與PPF得率均存在顯著差異(P<0.05)，其中，DO120菌株ES、SL誘導(dǎo)子得率最高，分別達(dá)5.048 7、12.548 2 mg/g，DO14菌株P(guān)PF誘導(dǎo)子得率最高，達(dá)到0.840 7 mg/g。不同菌株誘導(dǎo)子的得率表現(xiàn)出差異，是內(nèi)生真菌菌絲生長速率差異、菌絲代謝產(chǎn)物多樣性的體現(xiàn)。根據(jù)不同誘導(dǎo)子得率，可制備目標(biāo)菌株特異性誘導(dǎo)子，進(jìn)而探討誘導(dǎo)子的最佳生物學(xué)活性。

表2 不同菌株ES、SL、PPF誘導(dǎo)子得率比較(n=3)

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫字母表示在0.05水平上存在顯著差異?！?”表示全區(qū)組間比較后在0.05水平有顯著差異。

3 結(jié)論與討論

某些活性較強(qiáng)的內(nèi)生真菌往往對(duì)植物存在一定的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，于是學(xué)者們將內(nèi)生真菌制備成各種誘導(dǎo)子來研究其對(duì)植物生長與成分代謝的影響。結(jié)果表明，內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子也可以顯著影響植物的生長與成分代謝[19]。Wang等從紅豆杉(Taxuschinensis)樹皮中分離得到1株內(nèi)生真菌黑曲霉(Aspergillusniger)，將其制備成誘導(dǎo)子溶液添加到紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞體系中，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)子處理的紅豆杉紫杉醇含量提高了7倍，且誘導(dǎo)子濃度以碳水化合物總量計(jì)在40 mg/L時(shí)效果最好[20]。Zhao等將尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)Fat9菌株與鏈格孢屬(Alternariasp.)Fat15菌株制備成誘導(dǎo)子，添加到苦蕎麥(Fagopyrumtataricum)毛狀根培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)子溶液能顯著提高苦蕎麥毛狀根蕓香苷含量，且以多糖含量計(jì)Fat9、Fat15誘導(dǎo)子在濃度為200 mg/L時(shí)作用效果最好，蕓香苷含量分別達(dá)45.9、47.2 mg/L，分別是對(duì)照的 3.1、3.2倍[21]。Ming等在研究深綠木霉促進(jìn)丹參酮生物合成的分子機(jī)制的過程中，發(fā)現(xiàn)深綠木霉菌絲水溶性提取物中的蛋白-多糖部位(PSF)能夠顯著提高丹參酮生物合成途徑中4種關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)丹參毛狀根中丹參酮類成分的生物合成，且促進(jìn)效果明顯好于上清液部位(SF)，同時(shí)，PSF誘導(dǎo)子以可溶性糖含量計(jì)在濃度為300 mg/L時(shí)的作用效果顯著好于濃度為40、150 mg/L時(shí)的[22]。因此可見，誘導(dǎo)子可溶性糖濃度、化學(xué)部位、培養(yǎng)時(shí)間等會(huì)顯著影響內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子生物學(xué)活性。

本研究首先觀察了DO14、DO18、DO19與DO120在培養(yǎng)不同階段菌絲與發(fā)酵液的形態(tài)特征，并以可溶性糖含量為指標(biāo)，探討了不同培養(yǎng)時(shí)間EM誘導(dǎo)子溶液可溶性糖含量變化規(guī)律。結(jié)果表明，培養(yǎng)4 d時(shí)可溶性糖含量最高。以培養(yǎng)4 d的EM誘導(dǎo)子溶液為母液，用水提醇沉透析法分離成ES、SL與PPF 3個(gè)部位，根據(jù)不同部位的誘導(dǎo)子得率，可將ES、SL與PPF分別配制成不同濃度的誘導(dǎo)子加入鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)基中，探討誘導(dǎo)子對(duì)鐵皮石斛生長與有效成分含量積累的影響，從而為下一步誘導(dǎo)子生物學(xué)活性、物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制研究提供參考依據(jù)。