魏 群，曹 珊

(河南中醫(yī)藥大學， 鄭州 450046)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一個多因素共同參與的過程，可導致心腦血管疾病的發(fā)生。隨著年齡的增加，AS逐漸加重，目前已確定其與血栓形成、血管壁脂質(zhì)浸潤、血管平滑肌細胞(VSMC)增殖和黏附分子介導的炎癥反應密切相關(guān)，但其確切的發(fā)病機制尚未完全闡明[1]。研究顯示，同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)可誘導血管VSMC增殖及遷移，VSMC的異常增生與遷移是AS發(fā)生過程中重要的病理基礎[2]。我院自研的丹參通脈方(丹參、川芎、葛根、三七)具有調(diào)節(jié)血脂、降低血清Hcy水平的作用[3]。本研究探討丹參通脈方 Hcy誘導的血管平滑肌細胞增殖、遷移的影響，旨在分析其作用機制，更好地為臨床應用服務。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠，雌雄不限，購自鄭州大學實驗動物中心(合格證號SCXK 20090001)。

1.2 藥物及試劑

丹參通脈方為我院自制方，由丹參10 g、川芎5 g、葛根10 g、三七6 g組成，經(jīng)100 ml水煮，殘液旋轉(zhuǎn)蒸、凍干后得到。丹參、川芎、葛根、三七均經(jīng)我院鑒定。Hcy為Sigma公司產(chǎn)品(批號C-7352)； DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清為四季青公司產(chǎn)品(批號20160315)；蛋白提取試劑盒為上海哈靈生物公司產(chǎn)品(批號20160205)；4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)為sigma公司產(chǎn)品(批號D8200)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純劑試劑。

1.3 主要儀器

超凈工作臺(AIRTECH，蘇州凈化設備有限公司)；精密電子天平(梅特勒-托利多)；電動移液器(德國Eppendorff公司)；Western電泳儀(美國伯樂)；Western轉(zhuǎn)膜儀(美國伯樂)；低溫高速離心機(Eppendorf 公司)；CytomicsTMFC 500系列流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特)；Transwell小室(Chemicon公司)；轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Red公司)。

1.4 VSMC原代細胞培養(yǎng)和鑒定[2]

采用組織貼塊法培養(yǎng)SD大鼠胸主動脈VSMC，采用平滑肌肌動蛋白(SM-actin)免疫熒光鑒定 VSMC，并通過SM-actin與4’、 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染關(guān)系檢測VSMC純度，培養(yǎng)4～7 代后用于后續(xù)試驗。

1.5 分組與給藥

培養(yǎng)4～7 代的VSMC原代細胞調(diào)整細胞濃度為1×104/L，于24孔板加入細胞懸浮液，每孔細胞5×104個，細胞分為對照組、Hcy組(500 μmol/L Hcy)、丹參通脈方低劑量組(500 μmol/L Hcy+1 mg/L丹參通脈方凍干粉)、丹參通脈方高劑量組(500 μmol/L Hcy+10 mg/L丹參通脈方凍干粉)和瑞舒伐他汀組(500 μmol/L Hcy+1 mg/L瑞舒伐他汀)5組。

1.6 MTT法檢測細胞增殖能力

采用MTT法檢測細胞增殖活力。將對數(shù)期的細胞消化后，調(diào)整細胞濃度為1×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，在37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中孵育，至70%～80%細胞融合后各組相應加入藥物。對照組加入等量培養(yǎng)基，每組設6個復孔，同時設定空白對照組，分別培養(yǎng)48 h。PBS沖洗培養(yǎng)板，隨后加入MTT再培養(yǎng)4～5 h，棄上清加150 uL DMSO 溶解，于酶標分析儀490 nm波長處測各孔吸光度值，所得數(shù)值為各組值減去空白對照值，采用劃痕法檢測細胞遷移面積。

1.7 Transwell法檢測VSMC遷移

取將對數(shù)期的細胞消化后各組相應加入藥物，對照組加入等量培養(yǎng)基。各組24孔板配套的Transwell 小室下室加入10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基500 μL，上室加入200 μL 細胞懸液，分別培養(yǎng)4、8、12、24、48 h。結(jié)束后取下Transwell半透膜，PBS洗滌3 次，多聚甲醛固定，DAPI 染核后熒光顯微鏡下隨機取5個視野，統(tǒng)計穿膜細胞數(shù)量。

1.8 Western-blotting檢測NF-κB、CHOP和TRB3蛋白表達水平

將對數(shù)期的細胞消化后，調(diào)整細胞濃度為1×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，在37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中孵育，至70%～80%細胞融合后各組相應加入藥物，對照組加入等量培養(yǎng)基。每組設6個復孔，分別培養(yǎng)48 h。裂解VSMC提取總蛋白，Bradford法測定樣品的蛋白含量，12%的凝膠分離蛋白質(zhì)，利用轉(zhuǎn)膜儀(濕轉(zhuǎn))在100 V 1.5 h的條件下將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后與稀釋的NF-κB、CHOP和TRB3單克隆抗體(1∶1 000)過夜結(jié)合，洗模后加入稀釋的二抗，室溫孵育60 min，BeyoECL Plus顯色，凝膠成像和化學發(fā)光分析系統(tǒng)收集顯色條帶，運用 Quantity One 軟件進行蛋白條帶數(shù)據(jù)分析。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 VSMC原代培養(yǎng)及鑒定細胞圖

圖1顯示，大鼠胸主動脈VSMCs培養(yǎng)7 d 后組織塊周圍有細胞爬出，細胞融合傳代后呈典型“峰谷”狀排列生長，SM-actin細胞免疫熒光鑒定VSMC細胞純度>99%。

注：左：形態(tài)學觀察(×100)；右：細胞免疫熒光鑒定(×200)圖1 VSMC原代培養(yǎng)及鑒定細胞圖

2.2 各組細胞吸光度值測定結(jié)果

圖2顯示，與對照組比較，Hcy組細胞 24、48 h OD值顯著上升(P<0.05)；與Hcy組比較，丹參通脈方低劑量組、丹參通脈方高劑量組和瑞舒伐他汀組24、48 h OD值顯著下降(P<0.05)，且丹參通脈方高劑量組顯著低于丹參通脈方低劑量組(P<0.05)。

圖2 各組細胞吸光度值測定結(jié)果

2.3 各組細胞遷移情況比較

表1顯示，與對照組比較，Hcy組細胞遷移面積和穿透細胞數(shù)量顯著上升(P<0.05)；與Hcy組比較，丹參通脈方低劑量組、丹參通脈方高劑量組和瑞舒伐他汀組遷移面積和穿透細胞數(shù)量顯著下降(P<0.05)，且丹參通脈方高劑量組顯著低于丹參通脈方低劑量組(P<0.05)。

表1 各組細胞遷移比較

注：與對照組比較：*P<0.05；與Hcy組比較：▲P<0.05；與丹參通脈方低劑量組比較：△P<0.05

2.4 各組NF-κB、CHOP和TRB3表達比較

表1顯示，與對照組比較，Hcy組NF-κB、CHOP和TRB3表達水平顯著上升(P<0.05)；與Hcy組比較，丹參通脈方低劑量組、丹參通脈方高劑量組和瑞舒伐他汀組NF-κB、CHOP和TRB3表達水平顯著下降(P<0.05)，且丹參通脈方高劑量組顯著低于丹參通脈方低劑量組(P<0.05)。

表2 各組NF-κB、CHOP和TRB3表達情況比較

注：與對照組比較：*P<0.05；與Hcy組比較：▲P<0.05；與丹參通脈方低劑量組比較：△P<0.05

注：a：丹參通脈方低劑量組；b： Hcy組；c：丹參通脈方高劑量組；d：對照組；e：瑞舒伐他汀組圖3 Western-blotting檢測NF-κB、CHOP和TRB3表達水平

3 討論

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)及其所導致的心腦血管疾病是當今人類死亡的首位原因。目前已確定與AS發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的因素主要包括血管壁脂質(zhì)浸潤、血栓形成、損傷后的生物連鎖反應、血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC) 克隆增殖以及各種黏附分子介導的炎癥反應等，但其確切的病因至今尚未完全闡明。 因此，AS發(fā)生機制及治療靶點已成為國內(nèi)外學者研究的熱點。眾多研究表明，Hcy可通過誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoPlasmic reticulum stress, ERS)介導內(nèi)VSMC損傷和凋亡，從而啟動血栓形成，促進AS發(fā)生發(fā)展[4-6]。此外，Hcy還可通過活化NF-κB途徑上調(diào)VSMC內(nèi)組織因子的表達水平，促進VSMC增殖，并促進VSMC表型由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化[4-10]。因此，本研究中采用Hcy作為通過ERS/NF-κB網(wǎng)絡通路誘導VSMC損傷和增殖的刺激因子。

丹參通脈方以活血化瘀、通脈止痛組方，方中包含丹參、川芎、葛根、三七等專走血分的藥物，具有養(yǎng)血活血的作用。因此，目前臨床中多將丹參通脈方用于對高血壓并腦梗死、短暫性腦缺血發(fā)作、血瘀型下肢動脈硬化閉塞癥、動脈粥樣硬化和血栓閉塞性脈管炎等疾病的治療，并取得了較佳的臨床療效。

VSMC位于動脈血管的中層，具有多種功能，根據(jù)其功能不同分為收縮型和合成型2種表型。在正常情況下處于非增生狀態(tài)、內(nèi)表面有完整的內(nèi)皮細胞覆蓋即為收縮型。當內(nèi)皮細胞受損時，血液中的生長因子和細胞分裂因子通過平滑肌細胞表面的受體，激活細胞內(nèi)與表型有關(guān)的信號傳導系統(tǒng)，細胞由收縮型轉(zhuǎn)變成合成型并移行至內(nèi)膜迅速增生。而內(nèi)膜的大量增生將形成肌源性泡沫細胞，這是動脈粥樣硬化的重要病理學特征之一，因此抑制平滑肌細胞增殖是心血管疾病防治的重要手段。MTT和Transwell試驗數(shù)據(jù)表明，Hcy可誘導VSMC的增殖和遷移，丹參通脈方具有抑制VSMC增殖和遷移的作用，且呈劑量依賴方式。VSMC位于動脈血管的中層，具有多種生物學功能，其主要功能是收縮血管，但當血管發(fā)生炎癥反應激活細胞有關(guān)信號傳導系統(tǒng)，VSMC可被激活、增殖和遷移能力增加[11]，因此丹參通脈方具有抑制Hcy誘導的VSMC增殖和遷移作用。董宜旋等[12]報道稱，中藥丹參主要有效成分丹參酮ⅡA，可以抑制由Hcy誘導的VSMC增殖和遷移。我們的前期研究顯示，由丹參、川芎、葛根、三七組成的丹參通脈方在冠心病、腦動脈粥樣硬化、腦血栓治療方面效果顯著，具有調(diào)節(jié)血脂、降低血HCY水平、抗AS等作用。陳芳等[13]報道稱，丹參通脈方可有效干預頸動脈AS斑塊的發(fā)生發(fā)展，具有較好的防治AS作用。既往研究證實，葛根素具有調(diào)節(jié)血脂、保護VSMC、拮抗高Hcy誘導VSMC異常增殖等良好的抗AS作用[14-16]。

VSMC的增殖和遷移受多個信號通路的調(diào)控，以往研究多集中于單個信號通路進行研究。由于AS發(fā)生是多基因互動的結(jié)果，因此本研究中以ERS/NF-κB 2條密切相關(guān)的網(wǎng)絡通路綜合調(diào)控為主線，對丹參通脈方抗AS分子機制進行分析。NF-κB信號通路的異常激活與AS疾病的發(fā)生密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，在AS病灶中的巨噬細胞、VSMC等多種細胞中NF-κB多度活化[17-18]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是重要的細胞器之一，是蛋白質(zhì)合成、加工和運輸?shù)闹饕獔鏊?，同時在類固醇激素合成和脂質(zhì)代謝過程中具有重要作用。在多種因素刺激下，可導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能紊亂發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[19-23]。長期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激則啟動細胞凋亡。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激經(jīng)典的標志物之一，其表達上調(diào)則激活細胞死亡途徑，可介導細胞凋亡加重腦損傷[14]。TRB3蛋白是一種激酶類似蛋白，可與絲/蘇氨酸蛋白激酶AKT結(jié)合，從而參與細胞凋亡過程。當發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，CHOP表達上調(diào)促進TRB3基因的表達[24-27]。因此，丹參通脈方可能是通過ERS/NF-κB發(fā)揮抑制Hcy誘導VSMC增殖和遷移的作用。