安方玉，顏春魯，劉永琦，駱亞莉，劉雪松，李 楊，史旭鋒，張 雪

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學，蘭州 730000； 2. 甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學與中醫(yī)藥防治研究省級重點實驗室，蘭州 730000； 3. 敦煌醫(yī)學與轉化省部共建教育部重點實驗室，蘭州 730000)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種慢性炎癥性間質性肺疾病，病理特征主要以彌漫性肺泡炎、肺泡結構紊亂、肺纖維化為主[1]，由于其機制未明而導致臨床治療效果欠佳，故探索肺纖維化的發(fā)病機制和尋找合適的治療藥物是目前研究的熱點。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，瀉肺湯通過降低肺纖維化模型大鼠血清羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)含量和肺組織一氧化氮(nitric oxide，NO)含量，抑制肺組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)的活性而顯示出較好的抗肺纖維化效果[2]。為此，本實驗采用博來霉素氣管內(nèi)滴注法建立大鼠肺纖維化模型，通過觀察瀉肺湯對肺纖維化模型大鼠血清TGF-β1、TNF-α 含量和肺組織Bcl-2/Bax表達的影響，揭示其治療機制，為抗IPF 藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠84只，體質量(180-220)g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心提供(實驗動物質量合格證編號SCXK(甘)2011-0002-0002141)。

1.2 實驗藥物及給藥劑量

醋酸潑尼松片(江蘇鵬鶴藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號1404273)按照臨床用量換算配成0. 2 mg /mL混懸液。敦煌古醫(yī)方瀉肺湯中的葶藶子、生地黃、生大黃、竹葉、甘草5 味藥(購自甘肅冠蘭中藥飲片有限公司，批號分別為140303、140115、140418、140209、131112)按照臨床用量換算配成1、2、4 g /mL水煎劑。博來霉素(日本化藥株式會社， 批號415A025)用生理鹽水配成5 mg /kg 藥液備用。

1.3 試劑與儀器

一氧化氮(nitric oxide，NO)、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為20140805、20140820)；Rat TGF-β1precocated ELISA kit 和Rat TNF-α precocated ELISA kit檢測試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，批號20140801)；Bcl-2和Bax抗體(IMMNUWAY 公司)；Trizol Reagent 試劑(美國，批號471220)；反轉錄試劑盒和實時熒光定量試劑盒(Promega，批號分別為0000079124 和0000114842)；iMark型全自動酶標分析儀(美國Bio-Rad公司)；T6新悅-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；Molecular Imager ChemiDocTM XRS+With Image LabTM Software(BIO-RAD)；S1000TM Thermal Cycler(BIO-RAD)；7500 Real Time PCR System(英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥

SPF 級SD大鼠飲食、飲水5 d后，按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、模型組、瀉肺湯水煎劑低、中、高劑量組、陽性對照組每組14只。正常對照組除外，各組大鼠用10% 水合氯醛麻醉固定后，采用Szapiel 法[3]氣管內(nèi)注射博來霉素(5 mL/kg) 復制肺纖維化模型，正常對照組氣管內(nèi)注射等體積生理鹽水。術后第2天，灌胃給藥，瀉肺湯低、中、高劑量為10、20、40 g/kg，陽性對照組(醋酸潑尼松)劑量為1. 8 mg/kg。正常對照組及模型組給予等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)28 d。次日檢測各組大鼠的肺功能后，股動脈釆血處死大鼠，左肺進行肺泡灌洗，收集肺泡灌洗液分離血清摘取右肺備用。

2.2 清醒狀態(tài)下無創(chuàng)肺功能測定

末次給藥后次日開啟動物肺功能測定儀，將大鼠放入特定描記箱中，每次4 只，在大鼠無創(chuàng)和清醒狀態(tài)下描記吸氣時間(inspiratory time，TI)、呼氣時間(expiratory time，TE)、潮氣量(tidal volume，TV)和肺泡通氣量(alveolar ventilation，AV)等，測試完畢后保存結果并整理數(shù)據(jù)。

2.3 肺泡灌洗液中NO含量和NOS活性測定

剖胸、結扎右主支氣管，用14號針頭刺入氣管并行結扎，往氣管注入用生理鹽水2～3 mL，反復沖洗3～4次，收集沖洗液即肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fliud，BALF)約 4～6 mL，離心收集上清液8～10 min，比色分析法測定其上清液中NO含量和NOS活性。具體操作按照試劑說明書嚴格執(zhí)行。

2.4 血清TNF-α和TGF-β1含量測定

股動脈采血，常規(guī)方法制備血清備用。ELISA法測定轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。

2.5 肺組織bax和bcl-2基因表達測定

Trizol Reagent提取肺組織總RNA，測定RNA含量和260/280的比值。反轉錄合成 cDNA進行 PCR 擴增(熒光定量法)，擴增條件為：95℃預變性2 min， 95℃變性15 s，58℃退火45 s，60℃延伸1 min，35～40個循環(huán)。每樣品重復3次，數(shù)據(jù)以 2-△△Ct表示樣本中目的基因相對表達含量。其中，β-actin、bax 和bcl-2等引物均由 TaKaRa 寶生物工程(大連)有限公司設計并合成。其基因序列如下： bax上游引物：5’-gCAAAgTAgAAAAgggCgACA-3’，size：21，下游引物：5’-gACgAACTggACAgTAACATggA-3’，size：23；bcl-2上游引物：5’-AgAgTCTTCAgAgAACAgCCAggAg-3’，size：24，下游引物：5’- AACATCgCCCTgTggATgAC-3’，size：20；β-actin上游引物：5’-TggCACCCAgCACAATgAA-3’，size：19， 下游引物：5’-CTAAgTCATAgTCCgCCTAgAAgCA-3’，size:25。

2.6 肺組織Bax和Bcl-2蛋白表達測定

用預冷的組織蛋白裂解液(RPMI∶PMSF=1∶100)提取肺組織總蛋白，測定蛋白含量后調整蛋白濃度為50 μg/10 μL，每孔點樣 10 μL。電泳、轉膜、封閉，加一抗(山羊抗大鼠 Bax抗體、Bcl-2抗體和GAPDH 抗體)，4℃孵育過夜。洗膜后將膜置于山羊抗兔辣根酶標記的二抗中，室溫孵育2 h后，洗膜后加入ECL化學發(fā)光液顯影，Bio-Rad 凝膠成像儀采集信號并攝取凝膠圖像。

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 瀉肺湯對肺纖維化大鼠肺功能的影響

表1顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠TE、TV和AV等肺功能指標均顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，瀉肺湯各干預組大鼠TV和AV等肺功能指標顯著升高，瀉肺湯高劑量組大鼠TE肺功能指標顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

表 1 各組動物清醒無創(chuàng)狀態(tài)下肺功能指標變化比較

注：與正常對照組比較:**P<0.01；與模型組比較:▲P<0.05,▲▲P<0.01

3.2 瀉肺湯對肺纖維化大鼠NOS活性、NO含量、TNF-α含量和TGF-β1含量的影響

表2顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠NOS活性、NO含量、TNF-α含量和TGF-β1含量均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，瀉肺湯中、高劑量組和陽性對照組大鼠NOS活性、NO含量、TNF-α含量和TGF-β1含量均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

表2 各組動物NOS活性、NO含量、TNF-α含量和TGFβ1含量的檢測結果

注：與正常對照組比較:**P<0.01；與模型組比較:▲P<0.05,▲▲P<0.01

3.3 瀉肺湯對肺纖維化大鼠bax、bcl-2基因表達和蛋白表達的影響

表3圖1顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠肺組織bax基因表達和蛋白表達明顯升高，bcl-2基因表達和蛋白表達明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，瀉肺湯中、高劑量組和陽性對照組大鼠肺組織bax基因表達和蛋白表達均明顯降低，bcl-2基因表達和蛋白表達均明顯升高(P<0.05或P<0.01)。

表3 各組動物肺組織bax和bcl-2基因表達和蛋白表達結果

注：與正常對照組比較:**P<0.01；與模型組比較:▲P<0.05,▲▲P<0.01

Western-blot圖1 各組動物肺肌組織Bax、Bcl-2蛋白表達

4 討論

特發(fā)性肺纖維化屬于中醫(yī)學“肺痿”“肺脹”等范疇，病機涉及虛、瘀、濁等方面，因此治法以“益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、清熱祛瘀”為主。

瀉肺湯源自《輔行訣臟腑用藥法要》，由葶藶子、大黃、生地黃、竹葉、甘草5味中藥組成。方中葶藶子消痰平喘、利水消腫，大黃活血化瘀，生地黃養(yǎng)血潤燥，竹葉清解解毒，甘草益氣和中，瀉肺湯可能對肺纖維化具有治療作用。本課題組前期實驗已證實，瀉肺湯通過降低NO和Hyp 的含量，抑制NOS的活性達到防治肺組織纖維化目的[2]。

目前肺纖維化發(fā)病的確切機制未明，但有研究已證實[4-6]，肺纖維化發(fā)病過程中涉及氧化應激損傷、炎癥因子表達異常、細胞凋亡信號通路失常。

氧化應激損傷、細胞因子及其網(wǎng)絡的作用和細胞凋亡，一直是肺纖維化發(fā)生發(fā)展的關鍵因素。NOS是催化L-精氨酸產(chǎn)生NO的關鍵酶，生成的產(chǎn)物NO有擴張肺血管、減少白細胞和血小板聚集等作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α通過刺激TGF-β、IL-6等細胞因子的產(chǎn)生而促進成纖維細胞的增殖，也可以通過提高TGF-β的產(chǎn)生促進上皮間質轉化，還可以通過增加TGF-β1mRNA的穩(wěn)定性和轉錄促進TGF-β1的表達[8-10]。TGF -β1表達上調是產(chǎn)生肺、肝、腎等纖維化疾病的關鍵步驟，其參與機體胚胎發(fā)育、腫瘤生長分化、細胞增殖凋亡、纖維組織的修復和調節(jié)免疫反應等各種生物過程[11-14]。而Bcl-2和Bax則是調控細胞凋亡的關鍵蛋白[15]，Bcl-2抑制細胞凋亡，Bax是促進細胞凋亡[16]。因此，Bcl- 2的表達升高和Bax的表達降低有利于細胞的存活。有研究也證實，肺纖維化鼠Bcl-2基因及蛋白表達均下調[17-19]，因此在尋求治療肺纖維化藥物的研究中，增強機體的抗氧化能力，減弱機體的氧化能力，調控機體氧化/抗氧化之間的平衡，抑制TNF-α 和TGF-β1的生物制劑，已成為衡量肺纖維化療效的標準之一。本實驗結果顯示，瀉肺湯能不同程度地降低模型大鼠體內(nèi)NOS的活性及NO、TGF-β1和TNF-α含量，升高Bcl-2的基因及蛋白表達，降低Bax的基因及蛋白表達來發(fā)揮治療作用。

綜上所述，瀉肺湯對博萊霉素所致大鼠肺纖維化具有防治作用，其可能的機制是瀉肺湯通過上調Bcl-2的表達、降低Bax的表達和致纖維化細胞因子TGF-β1與TNF-α的含量來達到調節(jié)肺纖維化氧化應激損傷的的目的，從而實現(xiàn)其保護作用。