郭玉婷,王靜知,程德殊,余玨珂綜述,徐 冶審校

(吉林醫(yī)藥學(xué)院:1.臨床醫(yī)學(xué)院，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林 吉林 132013)

線粒體是細(xì)胞的“能量工廠”，能夠合成大量腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)為細(xì)胞供能。線粒體基質(zhì)Ca2+的濃度能夠影響丙酮酸脫氫酶的酶活性調(diào)節(jié)ATP的產(chǎn)生，從而調(diào)控能量代謝。線粒體Ca2+的攝取和釋放也對細(xì)胞的自噬與凋亡產(chǎn)生影響。正常狀態(tài)下，線粒體通過線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablize transition pore,MPTP)、線粒體單向轉(zhuǎn)運(yùn)體(mitochondrial calcium uniporter,MCU)緩沖胞漿內(nèi)Ca2+濃度。線粒體內(nèi)的Ca2+濃度升高會使內(nèi)膜上的鈉鉀鋰轉(zhuǎn)運(yùn)體(Na+/Ca2+Li+-permeable exchanger,NCLX)活性增強(qiáng)、MPTP開放，釋放線粒體內(nèi)Ca2+。若Ca2+過量堆積，則會產(chǎn)生活性氧，引起細(xì)胞的凋亡和壞死。在細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下，線粒體Ca2+濃度的升高會引起線粒體自噬，這種自噬對細(xì)胞起到保護(hù)作用，維持細(xì)胞的生命活動[1]，持續(xù)應(yīng)激下Ca2+會過量堆積導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

1 線粒體的Ca2+調(diào)節(jié)

1.1 線粒體的Ca2+攝取途徑

線粒體是第一個被發(fā)現(xiàn)參與Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞器，早在20世紀(jì)中期，科學(xué)家們就發(fā)現(xiàn)了離體的線粒體可以攝取Ca2+?，F(xiàn)在，人們認(rèn)為線粒體可以通過兩種不同的動力學(xué)模式的單向轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制攝取Ca2+。目前，JAKOB等認(rèn)為心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞主要是通過MCU和線粒體雷諾丁受體(ryanodine receptor,RyR)攝取Ca2+[2]。

Ca2+單向轉(zhuǎn)運(yùn)體的分子特性幾十年來一直是個謎，直到發(fā)現(xiàn)了一種新的蛋白MCU。敲除MCU幾乎完全抑制了離體線粒體對鈣的攝取，顯著減少了完整細(xì)胞中線粒體的Ca2+攝取。此外，使用膜片鉗檢測發(fā)現(xiàn)敲除MCU抑制了釕敏感的Ca2+電流。據(jù)此，推測MCU蛋白是負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)Ca2+的攝取。目前，線粒體的內(nèi)膜(inner mitochondrial membrane,IMM)上的MCU已被確立為線粒體Ca2+攝取的關(guān)鍵分子[3]。MCU是具有電生理特性的離子通道，通過MCU流入的Ca2+受電子傳遞鏈產(chǎn)生的IMM的電化學(xué)梯度驅(qū)動。MCU和MCU調(diào)節(jié)相關(guān)的分子共同組成完整的調(diào)節(jié)Ca2+攝取的復(fù)合物。這種MCU調(diào)節(jié)分子包括基礎(chǔ)MCU調(diào)節(jié)因子、線粒體鈣離子攝入蛋白1(mitochondrial calcium uptake 1,MICU1)和MICU2[4]，它們在MCU攝取Ca2+時發(fā)揮著十分重要的作用。

有趣的是，許多研究均表明沉默MCU能夠顯著減少線粒體內(nèi)Ca2+的攝取，但是HOLMSTROM和PAN等卻分別在MCU沉默的小鼠細(xì)胞線粒體中檢測到了大量的Ca2+[5-6]。這些結(jié)果表明MCU不是線粒體攝取Ca2+的唯一途徑。PAN等還發(fā)現(xiàn)，在沒有MCU的動物中線粒體Ca2+只是部分減少，表明MCU不是線粒體吸收Ca2+的唯一機(jī)制[7]。對這一現(xiàn)象最簡單的解釋是線粒體像其他細(xì)胞膜一樣，存在多種Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制。

1.2 線粒體的Ca2+釋放途徑

線粒體內(nèi)的Ca2+堆積會使NCLX增強(qiáng)。NCLX是Na+依賴的鈉鈣反向交換通道，能夠正向調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)Ca2+外流。這種Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)可以被地爾硫卓、氯硝安定及苯并硫氮雜卓類化合物抑制，其中CGP-37157最為常用[8]。

當(dāng)線粒體內(nèi)Ca2+濃度過高時，會引起膜上的MPTP開放[9]。MPTP的開放受線粒體內(nèi)Ca2+濃度的影響，低膜電位也可增加其開放率，關(guān)閉則受pH等因素影響。MPTP具有一個重要的性質(zhì)：MPTP開放引起的ADP增加和Mg2+/Ca2+的恢復(fù)是可逆的。這種可逆性決定了MPTP有持續(xù)和瞬時兩種開放模式，可以啟動細(xì)胞死亡的信號通路或維持細(xì)胞正常的功能[10]。最近NI等表明細(xì)胞質(zhì)中的鈣蛋白酶1過表達(dá)可以顯著增加活性氧的產(chǎn)生，指出了調(diào)節(jié)MPTP開放的可能機(jī)制[11]。有實(shí)驗表明鈣蛋白酶1在神經(jīng)細(xì)胞興奮性中毒或心肌細(xì)胞H9C2氧化應(yīng)激時能夠截斷糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3 beta,GSK-3β)。GSK-3β通過移除去磷酸位點(diǎn)Ser9、Thr390之一或全部被高度激活，GSK-3β的抑制有利于再灌注，而再灌注時導(dǎo)致鈣蛋白酶活化，加重線粒體Ca2+超載，引起細(xì)胞死亡[12]。因此，HURST等猜測截斷線粒體的GSK-3β會過度活化鈣蛋白酶1促進(jìn)親環(huán)蛋白D的磷酸化，進(jìn)而引起MPTP持續(xù)的開放以抵制鈣蛋白酶1引起的細(xì)胞死亡[13]。越來越多的證據(jù)表明，Ca2+是調(diào)節(jié)MPTP孔的中樞，可以直接調(diào)節(jié)MPTP本身，也可通過調(diào)節(jié)ADP/ATP平衡、線粒體跨膜電位(ΔΨm)、活性氧/活性氮水平和蛋白水平對MPTP進(jìn)行調(diào)控。

此外，線粒體還存在H+/Ca2+反向轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白Letm1(leucine zipper EF hand-containing transmembrane protein 1)。線粒體基質(zhì)中Ca2+濃度較低時，Letm1可轉(zhuǎn)運(yùn)Ca2+進(jìn)入；反之，轉(zhuǎn)運(yùn)Ca2+流出。脂質(zhì)體純化的重組蛋白研究表明Letm1促進(jìn)K+依賴性的電中性的H+/Ca2+交換[14]。值得注意的是，沉默Letm1，盡管在MCU的存在下，依然可以抑制Ca2+的內(nèi)流[15]。

2 線粒體Ca2+與細(xì)胞能量代謝

線粒體能為細(xì)胞的各種生命活動提供能量，其基質(zhì)內(nèi)含有三羧酸循環(huán)的全部酶類，內(nèi)膜上具有呼吸鏈酶系及ATP酶復(fù)合體，是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和形成ATP的主要場所。Ca2+作為第二信使可以調(diào)控離子通道、酶和基因的表達(dá)，幾乎參與了細(xì)胞內(nèi)所有的生理活動[16]。細(xì)胞能夠通過細(xì)胞器Ca2+攝取和釋放的信號通路來實(shí)現(xiàn)Ca2+信號編碼整個細(xì)胞的生命活動信息。線粒體通過緩沖胞漿中Ca2+濃度參與了這個調(diào)控過程并起到重要的作用。線粒體是雙層膜細(xì)胞器，能夠?qū)麧{中大量的Ca2+轉(zhuǎn)移至線粒體基質(zhì)。線粒體基質(zhì)Ca2+濃度增高時，Ca2+能夠與無機(jī)磷酸鹽或其他形式的磷酸鹽形成復(fù)合物起到緩沖作用，以便胞漿中的Ca2+繼續(xù)轉(zhuǎn)移至線粒體。同時，線粒體攝取Ca2+能夠活化基質(zhì)酶，通過激活丙酮酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶增加ATP的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)能量代謝[17]。此外，線粒體的Ca2+濃度在神經(jīng)元功能中也起著一定的作用[18]。如在亨廷頓病和阿爾茲海默病等神經(jīng)退行性疾病中，線粒體鈣穩(wěn)態(tài)受損是神經(jīng)元損傷的基礎(chǔ)[7]。

3 線粒體Ca2+與自噬

自噬的主要生理功能是吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并將其包被進(jìn)入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程，從而加強(qiáng)蛋白質(zhì)質(zhì)量、能量的控制，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。在各種類型的生理應(yīng)激(如營養(yǎng)缺乏、缺氧、病原體感染等)或藥物負(fù)荷的影響下會引起自噬的上調(diào)。在這種情況下，細(xì)胞主要是通過自噬來對抗刺激，使自身存活。因此，自噬受損會導(dǎo)致癌癥和神經(jīng)退行性障礙等疾病的發(fā)生。

自噬的本質(zhì)是細(xì)胞為了存活而產(chǎn)生的應(yīng)激，但持續(xù)的應(yīng)激會引起細(xì)胞死亡，其過程也受Ca2+調(diào)控。在哺乳動物細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是儲存Ca2+的主要細(xì)胞器，在胞內(nèi)Ca2+信號傳導(dǎo)通路中起著關(guān)鍵性的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的儲存和釋放主要取決于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+泵對Ca2+的攝取[19]，和肌醇三磷酸受體(inositol trisphosphate receptor,IP3R)、RyR對Ca2+的釋放[20]。尤其是IP3R誘導(dǎo)的Ca2+釋放在細(xì)胞自噬和凋亡中的作用已被證實(shí)[21]。在線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)緊密連接處，Ca2+可以從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)依次經(jīng)由IP3R和電壓依賴性離子通道流入線粒體。線粒體中Ca2+若積聚過多則會造成鈣超載，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間Ca2+傳遞必不可少的結(jié)構(gòu)，也為兩細(xì)胞器之間的相互作用提供了的平臺。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到線粒體低水平的Ca2+傳導(dǎo)是能量產(chǎn)生的基礎(chǔ)。如果Ca2+轉(zhuǎn)移至線粒體的過程受阻，ATP產(chǎn)生會隨之減少，造成細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比率上調(diào)，單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated kinase，AMPK)活化，活化的AMPK通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1或直接激活unc-51樣激酶1/2復(fù)合物觸發(fā)自噬[22]。此外，饑餓條件下，線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合位點(diǎn)會優(yōu)先形成自噬體。若敲除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體連接處的蛋白如線粒體融合蛋白2，會減少自噬體的形成[1]。

線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的緊密連接在線粒體自噬中有著重要的調(diào)節(jié)作用。在哺乳動物的成纖維細(xì)胞中，電子傳遞鏈的突變會引起一個變化：線粒體Ca2+攝取減少，但線粒體仍處于靜息電位且形態(tài)正常[23]。線粒體Ca2+攝取減少是由于線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)連接處減少和MCU復(fù)合物的位置被改變而減弱了其攝取Ca2+的特性。因此，基于線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的緊密連接有利于線粒體自噬和線粒體生物合成，線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜會為細(xì)胞提供有效的促存活機(jī)制[24]。

4 線粒體Ca2+與細(xì)胞凋亡

線粒體是把營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成ATP的主要細(xì)胞器，IMM與線粒體外膜(outer mitochondrial membrane,OMM)的結(jié)構(gòu)是這個功能發(fā)揮的基礎(chǔ)，其通透性的改變也影響著細(xì)胞的凋亡與否。OMM可允許高達(dá)分子量5000的分子通過，IMM則通透性極低，這種性質(zhì)是化學(xué)電位產(chǎn)生的基礎(chǔ)，也是氧化磷酸化和ATP產(chǎn)生所必需的。IMM的通透性在線粒體觸發(fā)和調(diào)節(jié)凋亡過程中似乎起著關(guān)鍵性的作用。線粒體的MPTP復(fù)合物能與IMM上的腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(adenine-nucleotide-translocator,ANT)結(jié)合，ANT與電壓依賴性陰離子通道形成內(nèi)外膜的連接[25]。應(yīng)激狀態(tài)下，IMM通透性增加，允許分子量小于1500的分子(包括質(zhì)子)自由通行，質(zhì)子進(jìn)入線粒體基質(zhì)，阻斷氧化磷酸化作用。此外，還會導(dǎo)致線粒體基質(zhì)滲透性腫脹，內(nèi)嵴折疊壓縮囊泡。同時，OMM通透性增加導(dǎo)致促凋亡蛋白如細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子核酸內(nèi)切酶G釋放到細(xì)胞質(zhì)中，這最終將導(dǎo)致胱天蛋白酶依賴性和非胱天蛋白酶依賴性的細(xì)胞凋亡。

線粒體不僅能為細(xì)胞提供大量能量，作為胞內(nèi)鈣庫之一也能通過調(diào)控Ca2+濃度來調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活與死亡[26]。在細(xì)胞受到一定刺激下，可活化磷脂酶C水解磷脂酰肌醇4,5-雙磷酸，生成肌醇三磷酸(inositol triphosphosate，IP3)和二酰甘油。IP3可以結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3R，激活Ca2+通道，使Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)流到胞漿。進(jìn)而引起線粒體對Ca2+的吸收，又可以通過NCLX進(jìn)行釋放，維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)。若線粒體鈣超載則會損傷線粒體，激活細(xì)胞色素C,活化胱天蛋白酶3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]。Ca2+在開始和完成凋亡途徑的細(xì)胞死亡過程也是至關(guān)重要的[28]。線粒體Ca2+的積累可以調(diào)節(jié)IMM上MPTP的開放，其伴隨著滲透性腫脹和線粒體膜的破裂，將會造成促凋亡因子如細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中。Ca2+在凋亡中的另一個作用是通過Ca2+介導(dǎo)的蛋白磷酸酶活化使Bad蛋白去磷酸化，并從胞漿向線粒體轉(zhuǎn)位，阻斷Bcl-2家族蛋白Bcl-xl的抗凋亡作用[12]。此外，被鈣蛋白酶裂解的Bid蛋白也可以通過截短Bid觸發(fā)線粒體途徑的凋亡[13]。

5 結(jié) 語

Ca2+通過各種機(jī)制穿梭于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞質(zhì)之間，調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生理活動。線粒體通過MCU、RyR等攝取Ca2+，通過NCLX、MPTP等釋放Ca2+，調(diào)節(jié)著自身與胞內(nèi)的Ca2+濃度，維持著Ca2+穩(wěn)態(tài)。而細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)是細(xì)胞死亡過程中普遍存在的現(xiàn)象。線粒體作為細(xì)胞死亡途徑的核心，在細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下，通過對Ca2+的攝取和釋放調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與自噬，且在Ca2+緩沖過程中起到至關(guān)重要的作用。線粒體的結(jié)構(gòu)和功能比較復(fù)雜，并處于不斷地融合、分裂的動態(tài)過程中，和各個細(xì)胞器之間聯(lián)系密切。目前，對于影響線粒體內(nèi)Ca2+升高和降低因素的了解還不是很全面，有必要深入研究線粒體內(nèi)Ca2+的傳導(dǎo)機(jī)制，以期更好地詮釋線粒體相關(guān)臨床疾病，為其提供新的線索。

[1] LI X N,SU J,XIA M H,et al.Caspase-mediated cleavage of Beclin1 inhibits autophagy and promotes apoptosis induced by S1 in human ovarian cancer SKOV3 cells[J].Apoptosis,2016，21(2):225-238.

[2] JAKOB R,BEUTNER G,SHARMA V K,et al.Molecular and functional identification of a mitochondrial ryanodine receptor in neurons[J].Neurosci Lett,2014，575:7-12.

[3] PECZE L,BLUM W,SCHWALLER B.Routes of Ca2+Shuttling during Ca2+Oscillations;Focus on the Role of Mitochondrial Ca2+Handling and Cytosolic Ca2+Buffers[J].J Biol Chen,2015，290(47):28214-28230.

[4] PLOVANICH M,BOGORAD R L,SANCAK Y,et al.MICU2,a paralog of MICU1,resides within the mitochondrial uniporter complex to regulate calcium handling[J].PLoS One,2013,8(2):e55785.

[5] HOLMSTROM K M,PAN X,LIU J C,et al.Assessment of cardiac function in mice lacking the mitochondrial calcium uniporter[J].J Mol Cell Cardiol,2015,85:178-182.

[6] PAN X,LIU J,NGUYEN T,et al.The physiological role of mitochondrial calcium revealed by mice lacking the mitochondrial calcium uniporter[J].Nat Cell Biol,2013,15(12):1464-1472.

[7] BECK S J,GUO L,PHENSY A,et al.Deregulation of mitochondrial F1FO-ATP synthase via OSCP in Alzheimer’s disease[J].Nat Commun,2016,7:11483.

[8] 王樂樂.線粒體Ca2+攝取中關(guān)鍵蛋白MICU1的結(jié)構(gòu)與功能研究[D].天津:南開大學(xué),2014.

[9] ELUSTONDO P A,NICHOLS M,NEGODA A,et al.Mitochondrial permeability transition pore induction is linked to formation of the complex of ATPase C-subunit,polyhydroxybutyrate and inorganic polyphosphate[J].Cell Death Dis,2016,2:160-170.

[10] HAWORTH R A,HUNTER D R.The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria.Ⅱ.Nature of the Ca2+trigger site[J].Arch Biochem Biophys,1979,195(2):460-467.

[11] NI R,ZHENG D,XIONG S D,et al.Mitochondrial Calpain-1 Disrupts ATP Synthase and Induces Superoxide Generation in Type 1 Diabetic Hearts:A Novel Mechanism Contributing to Diabetic Cardiomyopathy[J].Diabetes,2016,65(1):255-68.

[12] JIN N N,YIN X M,YU D,et al.Truncation and activation of GSK-3β by calpain I:a molecular mechanism links to tau hyperphosphorylation in Alzheimer’s disease[J].Sci Rep,2015,5:8187.

[13] HURST S,GOMEZ L,JHUN B,et al.Truncation of GSK-3β in Cardiac Mitochondria is the Master Switch of the mPTP[J].TFASEB J,2015,29(Suppl 1):979.

[14] TSAI M F,JIANG D W,ZHAO L L,et al.Functional reconstitution of the mitochondrial Ca2+/H+antiporter Letm1[J].J Gen Physiol,2014,143(1):67-73.

[15] JIANG D W,ZHAO L L,CLAPHAM D E.Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+antiporter[J].Science,2009,326(5949):144-147.

[16] RAFFAELLO A,MAMMUCARI C,GHERARDI G,et al.Calcium at the Center of Cell Signaling:Interplay between Endoplasmic Reticulum,Mitochondria,and Lysosomes[J].Trends Biochem Sciences,2016,41(12):1035-1049.

[17] DENTON R M.Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions[J].Biochim Biophys Acta,2009,1787(11):1309-1316.

[18] MA T,GONG K,YAN Y F,et al.Mitochondrial modulation of store-operated Ca2+entry in model cells of Alzheimer’s disease[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,426(2):196-202.

[19] VANDECAETSBEEK I,VANGHELUWE P,RAEYMAE-KERS L,et al.The Ca2+pumps of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2011,3(5):a004184.

[20] VAN PETEGEM F.Ryanodine receptors:allosteric ion channel giants[J].J Mol Biol,2015,427(1):31-53.

[21] DECUYPERE J P,PARYS J B,BULTYNCK G.ITPRs/inositol 1 4,5-trisphosphatereceptors in autophagy:from enemy to ally[J].Autophagy,2015,11(10):1944-1948.

[22] KIM J,KUNDU M,VIOLLET B,et al.AMPK and mTOR regulate autophagy through direct phosphorylation of Ulk1[J].Nat Cell Biol,2011,13(2):132-141.

[23] GRANATIERO V,GIORGIO V,CALT,et al.Reduced mitochondrial Ca2+transients stimulate autophagy in human fibroblasts carrying the 13514A>G mutation of the ND5 subunit of NADH dehydrogenase[J].Cell Death Differ,2016,23(2):231-241.

[24] MACVICAR T D,MANNACK L V,LEES R M,et al.Targeted siRNA screens identify ER-to-mitochondrial calcium exchange in autophagy and mitophagy responses in RPE1 cells[J].Int J Mol Sci,2015,16(6):13356-13380.

[25] GRIMM S.The ER-mitochondria interface:the social network of cell death[J].Biochim Biophys Acta,2012,1823(2):327-334.

[26] TOMAR D,DONG Z W,SHANMUGHAPRIYA S,et al.MCUR1 Is a Scaffold Factor for the MCU Complex Function and Promotes Mitochondrial Bioenergetics[J].Cell Rep,2016,15(8),1673-1685.

[27] FU Q Q,WEI L,SIERRA J,et al.Olfactory Ensheathing Cell-Conditioned Medium Reverts Aβ25-35-Induced Oxidative Damage in SH-SY5Y Cells by Modulating the Mitochondria-Mediated Apoptotic Pathway[J].Cell Mol Neurobiol,2017,37(6):1043-1054.

[28] ORRENIUS S,GOGVADZE V,ZHIVOTOVSKY B,et al.Calcium and mitochondria in the regulation of cell death[J].Biochem Biophys Res Commun,2015,460(1):72-81.