李永萍，溫書香

（1.漯河市召陵區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 漯河 462300；2.漯河市動物疫病預防控制中心，河南 漯河 462300）

1 病毒分離鑒定

就目前來說，鑒別診斷病毒種屬最有效、最準確的方法是病毒的分離鑒定。常用于豬藍耳病的分離培養(yǎng)的細胞主要有豬肺泡巨噬細胞、非洲綠猴腎細胞MA104以及其克隆株，不同的毒株類型對細胞系具有選擇性，例如歐洲型毒株更適合于在豬肺泡巨噬細胞上生長。鑒于不同的毒株對生長條件的選擇性，在病毒分離的同時，可以準備接種兩種以上的細胞。

豬藍耳病病毒對溫度和PH也比較敏感，因此對病料的保存和運輸要求比較嚴格，對于急性發(fā)病的豬只來說，采集病料成功分離病毒的概率比較大。在病豬的感染早期，肺組織、血清樣品常用于分離病毒。在病豬感染的中期，采集豬的肺組織比血清樣品更易于病毒的分離。此外，豬的口腔分泌物、精液等也可以作為病毒分離的材料。

2 病毒抗原的檢測

單克隆抗體因其具有較高的特異性、不易發(fā)生交叉反應等優(yōu)點常常被用來做豬藍耳病病毒抗原的檢測，用全病毒抗原或者多肽免疫產(chǎn)物作為免疫原獲得了5種特異性的單抗，其中N蛋白的免疫原性最強。用豬藍耳病全病毒免疫動物獲得的單抗多半是針對N蛋白的抗原表位的，這些單抗中有的是針對歐洲型和美洲型共同的抗原表位，有的只對一個毒株類型起反應。因此，在對豬藍耳病進行檢測的同時還可以達到分離歐洲型和美洲型的目的。病毒抗原的檢測主要用于對病毒分離物進行鑒定或者研究豬藍耳病病毒的一個動態(tài)分布。豬感染藍耳病病毒后，體內(nèi)產(chǎn)生的抗體長期存在，再加上抗原檢測時對病料的處理較為繁瑣，因此血清學檢測更適合于豬藍耳病的檢測和診斷。

3 血清學檢測

血清學檢測方法中常用的有以下幾種，其中免疫過氧化物酶細胞單層實驗在血清學檢測過程中表現(xiàn)出特異性強、敏感性高等優(yōu)點，已被畜牧獸醫(yī)學界得到廣泛的認可，該檢測方法在歐洲、美洲和亞洲國家經(jīng)常使用。該檢測方法的主要原理是應用相應的毒株感染豬肺泡巨噬細胞和CL2621單層細胞作為診斷用的抗原，在細胞培養(yǎng)的5～6d就可以檢測出抗體的存在。熒光抗體實驗方法在美國、加拿大和日本等國家較為常用，該檢測方法

敏感性和特異性都非常好，其抗原的制備過程與免疫過氧化物酶細胞單層實驗的制備過程一致。但這兩種方法有一個缺點就是這兩種檢測方法帶有一定的主觀性，不適合于大規(guī)模的臨床樣品檢測。血清中和試驗也常被用于豬藍耳病的檢測，這主要得益于血清中和抗體的持續(xù)時間要比免疫過氧化物酶細胞單層實驗和熒光抗體試驗的持續(xù)期長得多。但該方法也有不足的地方，例如該方法要求細胞培養(yǎng)，人力和財力資源的消耗比較大，檢測條件要求非常高，更為重要的是豬在感染藍耳病病毒后中和抗體出現(xiàn)的較晚。因此不利于疾病的早期診斷和急性病例的診斷。ELISA實驗室目前應用較多的一種檢測方法，該放操作過程簡便快捷，判定標準統(tǒng)一，特異性和敏感性都較高，血清中ELISA抗體出現(xiàn)的時間較早，持續(xù)的時間都較長。用于血清樣品檢測的抗原主要有兩種，一種是用細胞培養(yǎng)的全病毒，一種是重組的核衣殼蛋白，無論哪種抗原作為反應原，都難以消除較強的反應背景。

4 分子生物學檢測方法

分子生物學檢測方法常用的技術(shù)主要有原位雜交技術(shù)和RTPCR技術(shù)。其中原位雜交技術(shù)使用的探針主要針對豬藍耳病的ORF7進行設計。該檢測技術(shù)的敏感性高于免疫膠體金技術(shù)和免疫組化，檢出的持續(xù)時間更長久。豬藍耳病的毒株主要有美洲型和歐洲型，因此根據(jù)2種毒株核酸之間的差異設計探針，以此來區(qū)分基因型。此外，常規(guī)RT-PCR技術(shù)多用于對血清，精液和組織樣品的檢測。根據(jù)核酸片段設計的特異性引物還可以達到對毒株進行分型的目的。多重PCR技術(shù)在豬藍耳病的檢測上也經(jīng)常用到，該技術(shù)可以同時檢測2種和2種以上的病種，能夠有效鑒定病例是由哪種病毒引起的。RT-PCR-RFLP技術(shù)的原理主要是將組織病料經(jīng)過RT-PCR處理后，用限制性內(nèi)切酶進行RFLP分析，不但可以鑒別不同毒株之間的差異，還可以鑒別疫苗毒株和野毒感染。RT-nested PCR技術(shù)的原理根據(jù)藍耳病毒核酸設計一對通用引物，可以同時擴增歐洲型和美洲型片段，再設計一對引物能夠有效區(qū)分2個毒株類型，從而達到檢測和分型的目的。TaqMan熒光定量RT-PCR技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的實時熒光定量PCR技術(shù)，該檢測技術(shù)具有靈敏性好，敏感性高，重復性和特異性好等優(yōu)點。有研究表明該檢測技術(shù)要比常規(guī)的檢測方法的靈敏性高出100倍以上，但該技術(shù)也有一定的不足，例如，該技術(shù)的成本較高，設計的熒光探針對核酸序列的變化相當敏感。因此，該技術(shù)的關鍵點在于探針的設計。