◎ 趙月杰，程海芳，范雯婷，李宜哲

（河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，河南 鄭州 450047）

在發(fā)酵食品生產(chǎn)過程中，乳酸菌是使用較多的細(xì)菌之一，整個生產(chǎn)過程需要一定的特殊操作，要重點(diǎn)標(biāo)記一些產(chǎn)量多、性能良好的菌株，從而全方位把控生產(chǎn)質(zhì)量，提高生產(chǎn)的安全性，并且需要嚴(yán)格控制微生物，而最為有效的是以檢測方式來進(jìn)行，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建檢測乳酸菌的手段，對產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)及生產(chǎn)過程控制具有重要意義?，F(xiàn)有的檢測方法主要分為傳統(tǒng)檢測方法、分子生物學(xué)檢測方法和快速檢測方法。

1 乳酸菌的分類及生理功能

乳酸菌是可以發(fā)酵碳水化合物并產(chǎn)生大量乳酸的一類細(xì)菌的通稱，在自然界和食品中廣泛存在。乳酸菌通常涉及兩種類型：①乳酸菌屬于同型，在葡萄糖被分解后只有一種最終物質(zhì)——乳酸。②發(fā)酵乳酸屬于異型，而最終的產(chǎn)物不僅包括乳酸，同時會出現(xiàn)其他有關(guān)物質(zhì)，如二氧化碳、乙酸以及乙醇等。

乳酸菌在很多地方都存在，比如常見的臨床樣品、物料以及食品當(dāng)中都經(jīng)常見到，同時在很多動物的腸道當(dāng)中廣泛存在，其主要的生理功能有：①一些乳酸菌黏附在機(jī)體的腸道中，形成生理性屏障抵御有害菌，通過分泌不同酶類幫助機(jī)體消化食物，并為人體的代謝活動提供必需的維生素和氨基酸等物質(zhì)，同時能夠起到傳遞遺傳物質(zhì)的功能。②乳酸菌能夠調(diào)節(jié)氧化還原電位和pH值，主要是通過自身產(chǎn)生的醋酸和乳酸來抵制環(huán)境中有害菌落，從而創(chuàng)造一個良好的生存環(huán)境。③乳酸菌通過自身具有抗腐敗菌和病原菌的功能對病原菌的定植進(jìn)行干預(yù)，刺激組織發(fā)育、制造營養(yǎng)物質(zhì)、降低膽固醇、控制內(nèi)毒素以及誘發(fā)腸道免疫等，進(jìn)而對不同機(jī)體的應(yīng)急反應(yīng)、衰老過程、免疫反應(yīng)、腫瘤反應(yīng)、毒性反應(yīng)、細(xì)胞感染、藥物效應(yīng)、營養(yǎng)狀態(tài)以及生理功能產(chǎn)生一定作用。

2 乳酸菌的傳統(tǒng)檢測方法

2.1 乳酸菌的形態(tài)學(xué)觀察

作為一種最為普遍的檢測方式，形態(tài)學(xué)觀察主要有3種：①通過平板菌落來實(shí)現(xiàn)，觀察不同培養(yǎng)基、不同溫度以及不同時間菌落的變化。②利用光學(xué)顯微鏡，用革蘭氏染液染色菌落細(xì)胞，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察，若為革蘭氏陽性則初步判斷可能為乳酸菌。③電鏡觀察法。該方法通過透射電鏡掃描菌體細(xì)胞中的用磷鎢酸負(fù)染色法染色的染色體，從而得到菌落細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)和形態(tài)[1]，有時會利用投射電鏡觀察超切片，可以觀察到菌體內(nèi)部結(jié)構(gòu)[2]。

2.2 乳酸菌的生化鑒定

在生化鑒定過程中，其主要依照表型特征來實(shí)施，是生物學(xué)鑒定中經(jīng)常使用的方法，但由于整個操作環(huán)節(jié)比較復(fù)雜，經(jīng)常發(fā)生污染現(xiàn)象，因此，在使用時經(jīng)常容易受到限制，但是隨著生化鑒定條自動化和鑒定管的發(fā)展，生化鑒定再次受到重視，但仍舊限制在辨識力方面，因此主要以檢測鑒定分支方式參與到鑒定當(dāng)中[3]。實(shí)施生化鑒定時要依照相應(yīng)特征來實(shí)施，其中主要涉及明膠水解、吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)、氨基酸脫羧測定、脲酶測定、產(chǎn)氨試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、乙醇的氧化、乙酸的氧化、葡萄糖的氧化發(fā)酵測定以及糖類、氧化酶醇類的發(fā)酵試驗(yàn)等方法。

2.3 測定代謝產(chǎn)物

通過測定乳酸菌的菌體組分或代謝產(chǎn)物的含量實(shí)施菌種的鑒定，如分析細(xì)胞壁肽聚糖組分、乳酸旋光性分析，分析厭氧菌代謝產(chǎn)物主要有粒子色譜法、裂解法、液相色譜法、氣相色譜法以及層析法，使用最為普遍的是液相色譜和氣相色譜分析法，依照相關(guān)規(guī)定和標(biāo)準(zhǔn)，乳酸桿菌和雙歧桿菌必須鑒定的項目為屬間鑒定，必須使用氣相色譜法來實(shí)施。

3 分子生物學(xué)檢測方法

3.1 rDNA/rRNA序列的分子標(biāo)記

原核生物核糖體rRNA主要包括5S、16S、23S 3種類型，這3種rRNA含有的堿基數(shù)量分別為120個、1 540個以及2 900個。rRNA自身具有一定優(yōu)勢，其中包括保守性和高變性，比如確定生物物種是否存在關(guān)系時，利用其具有的保守性作為依據(jù)分析，而高變性主要體現(xiàn)在核酸序列具有的結(jié)構(gòu)特征方面，因此能夠?yàn)閷俜N鑒定提供依據(jù)[4]。生物發(fā)育指標(biāo)中最為合適的選擇是類似的rRNA基因序列和16SrRNA，所以在分析乳酸菌多樣性時會利用測量16SrRNA部分序列的方式。但是rDNA/rRNA序列的分子標(biāo)記法具有一定限制，在實(shí)施時只能對部分序列進(jìn)行分析，因此整體水平受到一定約束，并且整體實(shí)施時間比較長，測序成本相對比較高。

3.2 基于基因組DNA水平的分子標(biāo)記

3.2.1 RAPD

RAPD屬于DNA一種，但是歸屬到多態(tài)性和擴(kuò)增性范圍內(nèi)，主要原理是如果退火溫度不高，長度在10 bp上下的隨機(jī)寡核苷酸單引物，則能夠通過結(jié)合方式來與DNA序列融合為一體，從而有效擴(kuò)充引物之間的范圍，再通過電脈后的PCR產(chǎn)物能夠以多態(tài)性方式作為依據(jù)實(shí)施有效的鑒定。

RAPD在應(yīng)用時具有很多優(yōu)勢，比如整體操作過程簡單，分辨效果較好，在不需要了解基因組DNA序列信息基礎(chǔ)上就可以檢測，同時，RAPD自身具有一定劣勢，要想穩(wěn)定帶型，要確保電脈和PCR擴(kuò)增條件相同，比較短的擴(kuò)增引物，并且該方法難以得到良好的重現(xiàn)率，因此通常需要結(jié)合其他方法共同使用，比如結(jié)合溫度梯度凝膠電脈可以鑒定到種水平。

3.2.2 RFLP

RFLP作為一種限制性片段長度多態(tài)性檢測方式，在用DNA限制性內(nèi)切酶切割后，得到一定的DNA片段，基因間限制性片段長度差異化主要是由于酶切點(diǎn)的堿基出現(xiàn)缺失、重排以及替換。主要應(yīng)用流程：利用探針標(biāo)記DNA片段，并且利用轉(zhuǎn)模、凝膠電脈以及限制性內(nèi)切酶酶切后得到的DNA片段。近些年會融合PCR技術(shù)來實(shí)施檢驗(yàn)，降低整個檢驗(yàn)過程的難度。

3.2.3 AFLP

AFLP指的是擴(kuò)增片段長度多態(tài)性，作為分子標(biāo)記技術(shù)之一，早期發(fā)明始于荷蘭，在應(yīng)用過程中與其他類型的物種基因組DNA檢測方法有一定不同之處：①獲取一系列片段，這些片段含有黏性末端，并且主要通過限制性內(nèi)切酶切割得到。②在DNA片段末端連接雙鏈寡核苷酸接頭，利用選擇性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，主要擴(kuò)增限制性片段，并依照具體的擴(kuò)增片段長度是否存在來確定多態(tài)性。

4 乳酸菌的快速檢測方法

目前，乳酸菌鑒定大多仍沿用傳統(tǒng)方法，但是傳統(tǒng)分析法存在一定缺陷，比如關(guān)系密切與表型特性相似不等同、辨識度較低以及重現(xiàn)率較低等，所以要積極探究新的鑒定模式，從而提升鑒定效率，而分子鑒定技術(shù)主要以微生物為主，并且在乳酸菌基因組系統(tǒng)以及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上實(shí)施鑒定，從而有效發(fā)揮鑒定效果[5]。

4.1 實(shí)時熒光PCR技術(shù)

實(shí)時熒光PCR技術(shù)在20世紀(jì)90年代始于美國，實(shí)時熒光PCR技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用時能夠從定性的角度出發(fā)來實(shí)現(xiàn)定量目標(biāo)，并且檢測過程完全閉管，所以能夠防止出現(xiàn)交叉污染的現(xiàn)象。在檢測時利用定量PCR儀，并通過激光器電源發(fā)揮作用，能保障熒光激發(fā)的無干擾、高能以及穩(wěn)定效果。因此整個檢測過程能夠發(fā)揮操作簡捷、損耗低等優(yōu)勢。并且能夠有效檢測PCR產(chǎn)物積累：用雙標(biāo)記熒光探針可以對基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量。

4.2 變性高效液相色譜（DHPLC）

變性高效液相色譜是一種能夠應(yīng)用于微生物群落分析、監(jiān)測和鑒定的自動化新技術(shù)。目前，變性高效液相色譜廣泛應(yīng)用于不同行業(yè)當(dāng)中，比如基因克隆、分析甲基化、分析RNA、診斷人體疾病以及鑒定微生物等，但是在實(shí)際應(yīng)用時，以變性為基本條件，同源雙鏈核酸分子基因多樣性檢測主要通過異源雙鏈核酸分子來實(shí)現(xiàn)。

4.2.1 DHPLC原理

DHPLC主要利用離子對反相液相色譜技術(shù)對核酸片段進(jìn)行分離和分析。由于DNA分子帶負(fù)電荷，而分離用色譜柱的固相呈電中性疏水性，因此DNA分子本身不能直接吸附到柱子上。TEAA離子對試劑，可充當(dāng)“橋梁”幫助DNA分子與柱子固相填料表面分子結(jié)合，TEAA的陽性銨離子與DNA相互作用，同時烷基鏈與柱子的疏水表面相互作用。這樣DNA分子越長，結(jié)合的TEAA越多，與固相結(jié)合得越牢固[6]。

4.2.2 PCR-DHPLC檢測方法流程

抽取目標(biāo)檢測物中的樣品核酸，并通過PCR擴(kuò)增方式實(shí)施產(chǎn)物DHPLC分析，并以有效的條件來分離和洗脫DHPLC條件下核酸片段，收集相關(guān)數(shù)據(jù)、用WAVE System Software分析，獲取最終的報告，收集相應(yīng)片段時可以實(shí)施擴(kuò)增、鈍化以及測序[7]。

4.2.3 DHPLC在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用

很多病菌自身基因型存在差異，因此導(dǎo)致的病性也存在不同之處，但是在基因遺傳以及相關(guān)特性方面存在一定共同點(diǎn)，導(dǎo)致分型細(xì)菌出現(xiàn)一定的難度，DHPLC能夠分析DNA系列中細(xì)小的差異點(diǎn)，從而識別病原菌。DHPLC技術(shù)通過自身優(yōu)勢對病原微生物進(jìn)行準(zhǔn)確識別。用PCR引物，擴(kuò)增多種細(xì)菌的16S rRNA基因，獲取相應(yīng)的色譜峰圖，并以此作為細(xì)菌分類的依據(jù)[8]。

PCR-DHPLC技術(shù)方法在應(yīng)用時具有很多優(yōu)勢，比如自動化程度高、通量高以及儀器簡便，能夠有效降低成本費(fèi)用，并且隨著科學(xué)技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，PCR-DHPLC檢測應(yīng)用市場將越來越廣泛，并且相關(guān)軟件技術(shù)水平的提升能夠進(jìn)一步輔助DHPLC分析系統(tǒng)有效發(fā)揮自身作用，應(yīng)用到更多的行業(yè)當(dāng)中。

5 結(jié)語

乳酸菌的快速檢測方法越來越受到研究者的廣泛關(guān)注，其應(yīng)用前景和應(yīng)用價值也無限廣闊，特別是實(shí)時熒光PCR和DHPLC兩種快速檢測方的研究的逐漸深入，技術(shù)日趨完善，打開了乳酸菌快速準(zhǔn)確鑒定的大門。