(海南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,海南 ?？?570100)

0 引言

1887年，意大利發(fā)現(xiàn)首例禽流感，OIE將其劃為A類(lèi)傳染病，中國(guó)將此病劃為一類(lèi)傳染病。禽流感病毒屬于正黏病毒科，直徑為80～120nm，呈絲狀體等形態(tài)。囊膜表面有血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)兩種纖突。AIV最顯著的生物學(xué)特征之一是亞型眾多，至今已發(fā)現(xiàn)A型流感病毒的血凝素(HA)亞型有16種，神經(jīng)氨酸酶(NA)有10種亞型，通過(guò)基因重組形成具有新特征的病毒。各個(gè)亞型之間無(wú)交叉免疫性，給疫苗免疫造成很大困難，且禽流感一旦暴發(fā)往往給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)毀滅性的打擊，高致病性禽流感可以導(dǎo)致動(dòng)物及人類(lèi)死亡，因此，建立一種快速、高效的檢測(cè)方法是快速診斷方法是預(yù)防禽流感的重要途徑。

1 血清學(xué)檢測(cè)

1.1 血凝(HA)試驗(yàn)和血凝抑制(HI)試驗(yàn)

該試驗(yàn)既是WHO進(jìn)行全球流感監(jiān)測(cè)采用的普及方法,也是我國(guó)目前對(duì)禽流感感染和免疫的主要檢測(cè)手段。該方法操作簡(jiǎn)單、特異性高，但是需要排出NDV等病毒的干擾，不能直接檢測(cè)出病料中的病毒，并且可能出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

該方法敏感性好,可以檢測(cè)抗體及抗原,適用于大批血清樣品的檢測(cè)。目前,ELISA檢測(cè)方法的研究在國(guó)內(nèi)外發(fā)展很快,主要集中在診斷介質(zhì)和診斷試劑的改進(jìn)以及縮短診斷時(shí)間。有學(xué)者利用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備了H5N1亞型禽流感病毒(AIV)HA蛋白、類(lèi)病毒脂質(zhì)體和病毒樣顆粒,建立了相應(yīng)的檢測(cè)方法。試驗(yàn)表明,利用3種抗原包被所建立的ELISA方法均具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性,批間和批內(nèi)變異系數(shù)均小于10%,但單獨(dú)表達(dá)的HA蛋白和類(lèi)病毒脂質(zhì)體特異性更好,而且類(lèi)病毒脂質(zhì)體有更高的免疫反應(yīng)性,與滅活全病毒相比安全性更高,故在H5N1亞型AIV抗體水平檢測(cè)方面更具有應(yīng)用前景。

1.3 電化學(xué)發(fā)光免疫方法

亓文寶[1]等用釕聯(lián)吡啶標(biāo)記H9亞型AIV的單克隆抗體,用生物素標(biāo)記H9亞型AIV的多克隆抗體,優(yōu)化生物素化多抗和釕標(biāo)單抗最佳工作濃度,確定臨界值和反應(yīng)譜,對(duì)所建立的方法進(jìn)行敏感性、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果表明所建立的H9亞型AIV型特異性電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法可以用于臨床樣品檢測(cè),對(duì)H9亞型禽流感的監(jiān)測(cè)和防控具有重要意義。

1.4 納米熒光檢測(cè)方法

為了實(shí)現(xiàn)對(duì)禽流感病毒的簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)，有學(xué)者采用納米熒光標(biāo)記方法對(duì)H9亞型AIV進(jìn)行研究建立相應(yīng)檢測(cè)體系，研發(fā)適合H9亞型AIV早期感染現(xiàn)場(chǎng)診斷的納米熒光檢測(cè)試劑盒。結(jié)果表明:建立的H9亞型AIV納米熒光檢測(cè)卡特異性良好，與其他亞型AIV及禽類(lèi)呼吸道疾病病原無(wú)交叉性，靈敏度可達(dá)到0.031HA單位，本試驗(yàn)建立的H9亞型AIV納米熒光檢測(cè)卡特異和敏感，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，可用于H9亞型禽流感的檢測(cè)。

1.5 膠體金免疫層析法

劉曉燕[2]對(duì)HI效價(jià)最高單克隆抗體進(jìn)行純化,制備了金標(biāo)抗體玻璃纖維素膜；同時(shí)制備了兔抗H7亞型AIV血清并進(jìn)行純化,包被再硝酸纖維素膜上,最終制備了膠體金免疫層析試紙條。該試紙條特異性、敏感性及重復(fù)性均符合要求,可作為H7亞型禽流感快速診斷的檢測(cè)試劑。

2 分子生物學(xué)診斷方法

2.1 多重PCR

張曼[3]等根據(jù)GenBank已登錄的AIV的M基因、NDV的F基因和FAV-4的基因序列合成3對(duì)引物，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件,建立了同時(shí)鑒別3種病毒的多重PCR方法,并對(duì)其特異性、敏感性和重復(fù)性進(jìn)行檢驗(yàn)。該方法能快速鑒別3種病毒,敏感性較強(qiáng),結(jié)果顯明所建立的AIV、NDV和FAV-4多重PCR檢測(cè)方法可以用于臨床上3種病原的鑒別診斷。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

該方法是在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光物質(zhì)測(cè)每次PCR循環(huán)產(chǎn)物總量的方法。王晨曦[4]等通過(guò)分析NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中H7亞型AIV的HA基因序列,設(shè)計(jì)特異性引物,建立了針對(duì)北美H7亞型的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。該方法靈敏度可達(dá)53 Copies/μL。為監(jiān)測(cè)北美H7亞型AIV提供了良好的技術(shù)支撐,可用于外來(lái)AIV的監(jiān)測(cè)。

2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)

該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、不需要大型儀器設(shè)備、成本低廉、反應(yīng)時(shí)間短、結(jié)果判定簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),且具有比常規(guī)分子生物學(xué)方法更高的靈敏度和特異性。有研究針對(duì)H5亞型禽流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因8個(gè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)了3對(duì)擴(kuò)增引物,添加到RT-LAMP反應(yīng)體系中,并加入優(yōu)選的凍干保護(hù)劑進(jìn)行冷凍干燥。結(jié)果顯示該反應(yīng)體系可以凍干處理等步驟研制成試劑盒,經(jīng)驗(yàn)證該方法特異性好、敏感性高、并且操作簡(jiǎn)捷,適宜在基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室以及養(yǎng)殖場(chǎng)推廣應(yīng)用。

3 結(jié)語(yǔ)

近些年來(lái)禽流感的檢測(cè)技術(shù)有了很大的發(fā)展，但每種檢測(cè)方法都各具優(yōu)缺點(diǎn)，固定一種檢測(cè)手段很難滿足不同情況的檢測(cè)，比如在養(yǎng)殖場(chǎng)或疫情爆發(fā)地可以用膠體金診斷試紙條進(jìn)行初篩，這種方法不需要大型儀器、操作簡(jiǎn)單，且結(jié)果判定迅速，而進(jìn)行確診的時(shí)候就要借助大型儀器(如熒光PCR儀)進(jìn)行復(fù)診，如有需要可繼續(xù)按照病毒分離的方法進(jìn)行確診。因此，實(shí)際工作中應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)際情況比較各種檢測(cè)方法的優(yōu)劣，選擇合適的檢測(cè)方法。另外，應(yīng)推動(dòng)成熟的研發(fā)成果商品化，使檢測(cè)工作結(jié)果更加準(zhǔn)確快速便捷，促進(jìn)我國(guó)動(dòng)物醫(yī)學(xué)及畜牧業(yè)健康快速持續(xù)發(fā)展。