孟衛(wèi)京 薛晉杰 郝偉明 李紅霞*

1．山西省生殖科學研究所( 太原，030006) ;2． 山西省兒童醫(yī)院

目前耳聾已成為一種全球性疾?。?］。特別是對于新生兒及7 歲以下兒童而言，先天性耳聾發(fā)病率( 以我國新生兒群體為例) 達1‰～3‰，已成為最常見的出生缺陷之一［2］?，F(xiàn)已證實，50%以上的先天性耳聾與遺傳因素有關，尤其是易感基因( 如GJB2、SLC26A4、GJB3、12S rRNA 等) 的單堿基突變［3-4］。其中線粒體DNA( mtDNA) 12S rRNA 1555A＞G 及1494C＞T 突變不但可引起先天性非綜合征耳聾( NSHL) 及綜合征耳聾( SHL) ，更與氨基糖苷類抗生素導致的藥物性耳聾有直接關聯(lián)［3-4］。與NSHL 相比，藥物性耳聾在人群中具有更高的發(fā)生頻率［3，5］。本文對近3 年山西省晉城地區(qū)40 240 例新生兒12S rRNA 1555A＞G 和1494 C＞T 的突變篩查結果進行分析，對相關問題進行初探。

1 對象與方法

1．1 研究對象

2015 年7 月1 日—2017 年12 月31 日在山西省晉城地區(qū)的城區(qū)、高平市、澤州縣、陵川縣、沁水縣等19 家醫(yī)院出生的新生兒共計40 240 例。其中城區(qū)14 322 例，高平市10 524 例，澤州縣10 041 例、陵川縣3241 例、沁水縣2112 例。

1．2 研究方法

在征得新生兒監(jiān)護者的知情同意并簽署知情同意書后，于新生兒出生后3 ～7d 內(nèi)采集足跟末梢血，制成干血斑( 直徑＞8mm) ，4℃冰箱保存。實驗時以6mm 打孔器打下血斑，用廣州凱普生物科技有限公司的核酸提取試劑盒( 離心柱型) 進行DNA 抽提( 每個樣本DNA 終濃度≥10ng/μl) ，經(jīng)PCR 擴增目的基因片段后，利用低密度基因芯片-導流雜交平臺進行12S rRNA 1555A＞G、1494 C＞T 熱點突變檢測。

1．3 統(tǒng)計學分析

2．3 線粒體12S rRNA 1555A＞G 及1494 C＞T 在不同地區(qū)新生兒中的攜帶情況

2 結果

2．1 基因突變檢測

40 240 例新生兒中共發(fā)現(xiàn)突變攜帶者135 例，總攜帶率3．4‰。其中1555 A＞G 攜帶者133 例( 均質(zhì)突變99 例，異質(zhì)突變34 例) ，攜帶率3．3‰;1494 C＞T 突變僅發(fā)現(xiàn)2 例( 晉城城區(qū)、高平市各1 例) ，攜帶率0．05‰，均為均質(zhì)突變。見表1。

表1 藥物敏感性耳聾基因(線粒體12S rRNA)突變在晉城市不同地區(qū)發(fā)生情況(例)

2．2 12S rRNA 1555A＞G 在晉城不同地區(qū)男女新生兒間的分布

40 240 例新生兒中，男嬰20 459 例，女嬰19 781 例( 男女性別比為1．03: 1) 。男嬰中1555A＞G突變者72 例( 攜帶率3．5‰) ，女嬰中突變者61 例( 攜帶率3．1‰) 。各地區(qū)內(nèi)男女嬰突變攜帶率無統(tǒng)計學差異。見表2。

表2 線粒體12S rRNA 1555A＞G 在晉城五大地區(qū)男女新生兒中的分布

晉城地區(qū)12S rRNA 1555A＞G 與全國其它地區(qū)相比，發(fā)生率處于較高水平，尤其是高平市，達4．5‰，在各省中居首位。見表3。

表3 粒體12S rRNA 1555A＞G 及1494 C＞T 在不同地區(qū)新生兒中攜帶情況

3 討論

在導致遺傳性耳聾的各種病因中，mtDNA 突變與母系遺傳的綜合征耳聾( SHL) 及非綜合征耳聾( NSHL) 均密切相關［3，15-16］。其中12S rRNA 基因1555A＞G 和1494C＞T 作為當前研究的熱點，已被證實與氨基糖苷類抗生素造成的藥物敏感性耳聾有直接關聯(lián)—當編碼區(qū)高保守序列中的第1555 或1494位核苷酸堿基發(fā)生突變，尤其是均質(zhì)突變后，可導致12S rRNA 的二級結構發(fā)生轉(zhuǎn)變( 更接近于細菌16S rRNA 的二級結構) ，使之成為了氨基糖苷類藥物作用的靶點，增加了突變攜帶者對此類耳毒性藥物的敏感性，進而在誤用該類藥物后可導致不同程度的聽力損傷，甚至完全失聰［4，17］。對于異質(zhì)突變，耳毒性藥物使用后造成的聽力損傷情況主要取決于突變的線粒體所占的比例［18］。

1555A＞G 是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的、發(fā)生率最高的12S rRNA 基因致病突變，但其發(fā)生率在不同的人種、國家、地區(qū)之間存在著明顯差異。例如在NSHL 患者中，日本人攜帶率為3．4‰［19］，印度尼西亞人攜帶率達5．3‰［20］，丹麥人攜帶率為2．4‰［21］，突尼斯人則為1‰［22］。就我國新生兒群體而言，一項涉及11 個省份的隊列研究顯示:1555 A＞G 突變( 包含均質(zhì)突變與異質(zhì)突變) 的平均攜帶率約為1．2‰［5］。此外，近年許多臨床研究也顯示1555 A＞G 突變在山西省以外的全國大部分地區(qū)新生兒中的發(fā)生率普遍介于1‰～3‰［6-13，23-24］。雖然有研究顯示河北省邯鄲市的1555 A＞G 突變發(fā)生率達4‰，但樣本量較少( 1000 例)［13］，故其結果的代表性有待商榷( 包括1494C＞T 的高發(fā)生率) 。

在本研究中，我通過對山西省晉城市五大地區(qū)近3 年的取樣監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)新生兒12S rRNA 1555A＞G的攜帶率為3．3‰( 133/40240) ，明顯高于山西省以外的全國大部分地區(qū)。尤其是高平市，1555A＞G 突變的攜帶率高達4．5‰( 47/10524) ，不僅遠高于本省以外的大部分省市，也高于省內(nèi)其它地區(qū)( 長治市) 的報道結果。

導致晉城地區(qū)新生兒中12S rRNA 1555A＞G 高攜帶率的原因可能有以下幾點:①抽樣因素;本研究的樣本來源覆蓋了晉城五大地區(qū)接近全部的縣級以上醫(yī)院以及設有產(chǎn)科的部分鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院，如晉城城區(qū)、高平市、澤州縣的篩查人數(shù)占到了當?shù)爻錾丝跀?shù)的80%、95．3%、94%，均接近于當?shù)爻錾丝跀?shù)，因此可排除因抽樣誤差導致的結果偏倚。②環(huán)境因素:與核基因組DNA 相比，mtDNA 更容易受到環(huán)境因素影響，進而出現(xiàn)更高的突變率。2012 年中國出生缺陷監(jiān)測調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，山西省八大采煤區(qū)的神經(jīng)管畸形發(fā)病率明顯高于全國平均發(fā)病水平［23］。據(jù)此推測晉城地區(qū)線粒體12S rRNA 1555A＞G 突變總攜帶率( 3．3‰) 遠高于全國平均水平( 1.2‰) ，可能與所在環(huán)境有關，但其具體關聯(lián)性及其影響機制還需進一步探究和論證。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)新生兒中，男嬰的耳聾基因突變發(fā)生率明顯高于女嬰，尤其是GJB2 及SLC26A4基因突變。但mtDNA 突變發(fā)生率在男、女嬰中沒有統(tǒng)計學差異［12］。本次調(diào)查的40 240 例新生兒中，男嬰1555A＞G 突變攜帶率3．5‰，女嬰突變攜帶率( 3．1‰) ，兩者無統(tǒng)計學差異( P=0．56) 。5 個地區(qū)中男、女嬰突變攜帶率也無統(tǒng)計學顯著性差異。與之前報道的結論一致。

與1555A＞G 突變相比，1494C ＞T 突變在中國NSHL 患者中的攜帶率明顯偏低［24］，在新生兒中的攜帶率也較低，一般為0．1‰～2‰( 表4) 。本研究中，該突變在晉城地區(qū)中的總發(fā)生率僅為0．1‰( 2/40 240) ，與山西以外的其它大部分地區(qū)報道的結果基本一致。因此是否有必要將該位點列為新生兒耳聾基因檢測/篩查項目的必測位點，同樣有待商榷和論證。

綜上所述，通過對晉城地區(qū)新生兒群體近3 年的采樣監(jiān)測及分析，發(fā)現(xiàn)作為山西中南部的代表地區(qū)，晉城地區(qū)有著明顯高于全國大部分省市的藥物敏感性耳聾基因突變發(fā)生率，突變形式主要是1555A＞G，其中又以均質(zhì)突變?yōu)橹鳌Ｌ崾驹诒臼∵€需加大推進新生兒耳聾基因檢測/篩查項目的力度，擴大檢測的覆蓋范圍同時加強隨訪，以期更大程度上降低新生兒耳聾，尤其是藥物敏感性耳聾的發(fā)生率。