原亞莉，賀桂芳，馬 莉，張浩軍，卞美璐，楊文艷，張 媛

（1.清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100016；2.中日友好醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100029；3.中日友好臨床醫(yī)學(xué)研究所 藥理室；4.北京大學(xué)中日友好臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029）

持續(xù)的高危型人乳頭瘤病毒感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的主要原因[1，2]。目前常用的HPV 病毒檢測為HPV-DNA 分型檢測，2012年指南提出HPV 16/18 型感染者應(yīng)直接行陰道鏡檢查，然而大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為一過性感染致癌的可能性小，且其他高危型別中也有可能發(fā)展為宮頸癌的高危人群，因此HPV 分型檢測不能區(qū)別一過性感染和真正發(fā)生宮頸癌的高風(fēng)險人群。在HPV 病毒基因組中，E6/E7 基因是主要的致癌基 因[3～5]，E6/E7 蛋白在初始感染階段即一過性感染階段只有低水平表達，在持續(xù)感染階段有較高水平表達[6]。本研究擬通過E6/E7 蛋白檢測來篩選出真正可能發(fā)展為宮頸癌的高風(fēng)險人群，提高病變的檢出率，避免不必要的陰道鏡檢查帶來的創(chuàng)傷。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2015年11月～2017年11月期間中日友好醫(yī)院婦產(chǎn)科宮頸病變門診就診及住院的進行液基細胞學(xué)檢測（LCT）、高危型HPV-DNA 檢測以及于陰道鏡檢查下行活體組織病理檢查或?qū)m頸錐切病理檢查的400 例患者。根據(jù)組織病理學(xué)結(jié)果分為正常/炎癥45 例，CIN-1 91 例，CIN 2-3 220例，宮頸癌44 例。患者年齡22～71 歲，平均年齡40.32 歲。所有患者均知情同意。

從上述400 例選取于門診就診的53 例HPV 16/18 型陽性患者的液基細胞學(xué)檢測剩余標(biāo)本重新制片進行免疫細胞化學(xué)染色，另取10 例HPV陰性的正常人作為對照，檢測E6 和E7 蛋白的表達水平，分析其表達水平與組織病理學(xué)結(jié)果符合情況。

1.2 實驗方法

1.2.1 液基細胞學(xué)檢查

于宮頸鱗柱交界部位取材，放入專用的保存液中，在去除血液、粘液以及大多數(shù)炎性細胞后，制片染色，通過顯微鏡閱看載玻片分析結(jié)果。細胞學(xué)診斷采用TBS（The Bethesda system）分級系統(tǒng)。

1.2.2 人乳頭瘤病毒DNA 檢測

采用熒光PCR 技術(shù)對上述400 例患者進行HPV分型檢測。按照高危人乳頭瘤病毒基因分型檢測試劑盒（上海之江生物科技股份有限公司）提供的操作要求進行病毒核酸提取和擴增試劑的配制，可檢測出13 種高危型亞型及2 種低危型亞型。

1.2.3 陰道鏡活組織檢查

陰道鏡檢查前應(yīng)排除陰道毛滴蟲、淋病奈瑟菌等感染。患者取膀胱截石位，窺器暴露宮頸，用宮頸鉗取醋白上皮或碘不著色區(qū)等多點部位送病理檢查。根據(jù)病變的嚴(yán)重程度將病理診斷分為：慢性宮頸炎、CIN 1 級、CIN 2 級、CIN 3 級及浸潤性癌。

1.2.4 免疫細胞化學(xué)染色

采取上述所選53 例患者和10 例正常人的LCT 剩余保存液，重新制片行免疫細胞化學(xué)染色檢測E6/E7 蛋白。HPV l6/18 E6 單克隆抗體（稀釋濃度：1：100）、HPV 16 E7 單克隆抗體（稀釋濃度：1：400）均購自Abcam 公司。用已知陽性的宮頸癌病例作陽性對照，用PBS 替代一抗作陰性對照。陽性細胞： 細胞核中或細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕色染色視為E6/E7 蛋白陽性。確定陽性標(biāo)準(zhǔn)：任選10 個高倍鏡視野，按陽性細胞所占上皮細胞的百分比劃分。分為4 組：陰性，0～9%；輕度，10%～25%；中度，26%～50%；重度，＞51%陽性細胞。至少需要2位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生雙盲法觀察，陽性細胞率≥10%者為陽性。

1.3 觀察指標(biāo)

以宮頸組織病理學(xué)診斷結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，分析HPV 各亞型的分布情況，觀察HPV E6 和E7蛋白的表達水平與組織病理學(xué)結(jié)果符合情況。在不同級別宮頸病變（≤CIN1 組與≥CIN2 組之間）比較HPV-DNA 檢測與E6/E7 蛋白檢測的臨床應(yīng)用價值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 年齡分布

以宮頸組織病理學(xué)診斷結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，CIN1及以上者視為陽性。陽性355 例：年齡＜30 歲53例（14.9%）；30～39 歲133 例（37.5%）；40～49 歲89例（25.1%）；50～59 歲57 例（16.1%）；≥60 歲23例（6.5%）?？芍獙m頸上皮內(nèi)病變發(fā)病高峰在30～39 歲。其中宮頸癌患者44 例：年齡＜30 歲4 例（9.1%）；30～39 歲8 例（18.2%）；40～49 歲11 例（25.0%）；50～59 歲14 例（31.8%）；≥60 歲7 例（15.9%）。宮頸癌發(fā)病高峰在50～59 歲。

2.2 HPV 各亞型的分布情況

HPV 陰性的患者中，組織病理學(xué)為正常或炎癥者占31.3%（10/32）； 感染HPV-16 型的患者中，病理診斷為高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌者（≥CIN 2）占87.9%（145/165），感染HPV-18 型的患者中，病理診斷為高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌者占70.8%（17/24），最低的亞型為HPV-66 20.0%（5/25）。在炎癥、CIN 1 中HPV-16/18 型感染所占的比例較低；在CIN 2-3 中，HPV-16 型感染占50.4%，HPV-18 型感染占4.7%；在宮頸癌患者中，HPV-16 型占63.4%，HPV-18 型占14.6%。本研究資料得出78.0%的宮頸癌是由HPV-16/18型引起的，9.8%（4/41）由HPV 其他型別引起。在所有患者中，HPV 各亞型感染率從高到低依次為16＞52/58＞56/51/31/66/18（見表1）。因400 例患者中大部分為住院患者，所以并不是在HPV 陰性患者中5/32 會致宮頸癌。一般從宮頸上皮內(nèi)病變發(fā)展為浸潤癌需10～15年，且宮頸癌5年存活率低。按人次來統(tǒng)計，因有部分混合型感染的患者，所以總計人數(shù)大于400 例。

2.3 HPV E6 和E7 蛋白的表達水平與組織病理學(xué)結(jié)果符合情況

10 例正常人的HPV（-），E6/E7 蛋白也為陰性。組織病理診斷為炎癥或CIN1 的15 例患者中，E6 蛋白的陽性率為20.0%，E7 蛋白的陽性率為26.7%；病理診斷為CIN 2-3 或癌癥的38 例患者中，E6 蛋白的陽性率為71.1%，E7 蛋白的陽性率為84.2%。研究結(jié)果顯示，隨著病變級別的增加，HPV E6/E7 蛋白的陽性表達率也逐漸增加，在不同級別宮頸病變（≥CIN 2 組與≤CIN 1 組）間表達水平具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）（見表2～4）。

E6 蛋白檢測高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌（≥CIN 2）的靈敏度、特異度、陽性及陰性預(yù)測值分別為71.1%、80.0%、90.0%、52.2%；E7 蛋白的靈敏度、特異度、陽性及陰性預(yù)測值分別為84.2%、73.3%、88.9%、64.7%（見表5）。LCT 檢測高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌的靈敏度、特異度、陽性及陰性預(yù)測值分別為63.2%（24/38）、86.7%（13/15）、92.3%（24/26）和48.1%（13/27）。HPV-DNA 檢測的陽性預(yù)測值為71.7%（38/53）。結(jié)果表明，HPV E6 蛋白和E7 蛋白檢測的靈敏度與陰性預(yù)測值均高于LCT 檢測，陽性預(yù)測值均高于HPV-DNA 檢測（分別為90.0% vs 71.7%，88.9% vs 71.7%）。

表1 不同組織病理學(xué)病變中HPV 各亞型的分布情況（n）

表2 不同組織病理學(xué)檢查結(jié)果的患者HPV E6 蛋白的陽性表達情況（n）

表3 不同組織病理學(xué)檢查結(jié)果的患者HPV E7 蛋白的陽性表達情況（n）

表4 HPV E6/E7 蛋白在不同級別宮頸病變中的表達水平 n（%）

表5 HPV-16/18 型陽性患者中E6、E7 蛋白表達對高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌的預(yù)測價值

3 討論

宮頸癌及癌前病變的篩查方法主要是LCT與HPV 檢測，目前常用的HPV 檢測方式是HPV-DNA 檢測。本研究結(jié)果顯示：感染HPV 16型的患者中，病理診斷為高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌者（≥CIN 2）占87.9%；感染HPV 18 型的患者中，占70.8%。因此，HPV 16/18 型與宮頸癌關(guān)系尤為密切。2012年指南指出HPV 16/18 型感染者直接行陰道鏡檢查，但是一過性感染導(dǎo)致宮頸癌的可能性小，HPV-DNA 整合入宿主DNA 是宮頸癌發(fā)生的關(guān)鍵步驟[7，8]。

HPV-DNA 檢測是基于L1 片段（查病毒），而L1 不是致癌基因，且在整合過程中容易發(fā)生缺失，故以L1 區(qū)為目標(biāo)檢測物的HPV 檢測存在假陰性風(fēng)險[9]，不能區(qū)分一過性感染和真正發(fā)展為癌的高風(fēng)險人群。E6/E7 才是使細胞發(fā)生永生化的致癌基因，其編碼的E6 和E7 蛋白通過降解p53 抑癌蛋白和干擾pRB 蛋白，破壞細胞衰老、凋亡和遺傳穩(wěn)定性的正常調(diào)控，導(dǎo)致細胞發(fā)生永生化[10～13]。故而很多學(xué)者提出E6/E7 基因是檢測高危型人乳頭瘤病毒的關(guān)鍵靶點[14，15]，其可直接檢測宮頸病變，而不僅僅是檢測HPV 病毒感染。

本研究結(jié)果顯示53 例HPV 16/18 型感染的患者中，E6 蛋白在炎癥、CIN 1、CIN 2-3 和宮頸癌中的陽性表達率分別為0%、37.5%、64.0%、84.6%，E7 蛋白的陽性表達率分別為14.3%、37.5%、80.0%、92.3%。隨著病變級別的增加，HPV E6/E7 蛋白的陽性表達率逐漸增加，不同級別宮頸病變（≤CIN 1 組比≥CIN 2 組）之間的表達水平具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。HPV E6 蛋白和E7蛋白檢測的靈敏度與陰性預(yù)測值均高于LCT 檢測，與Zhang 等[16，17]研究結(jié)果相符。HPV E6、E7 蛋白檢測的陽性預(yù)測值（90.0%、88.9%）均高于HPV-DNA 檢測（71.7%）。本研究中，在高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌（≥CIN 2）中，E6 蛋白的陽性率為71.1%，E7 蛋白的陽性率為84.2%，說明E6/E7 蛋白在診斷和預(yù)測高度鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌方面具有重要的參考價值。

因此，建議臨床行LCT 檢測或陰道鏡時，進行E6/E7 蛋白檢測，將其作為一個篩查的重要指標(biāo)。本研究所選取的研究對象有限，有待深入研究進一步加以證實。