代潔瓊 賈欣 喬巧玉 王志華 趙欣 杜振瑩 關(guān)曉雅 張宇

【摘要】 本文通過查詢文獻(xiàn)并結(jié)合筆者的實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)，介紹微透析技術(shù)原理，以及利用微透析技術(shù)進(jìn)行清醒大鼠rACC腦區(qū)定位取樣的方法。

【關(guān)鍵詞】 微透析； 透析液； 立體定位； rACC腦區(qū)； 大鼠

前扣帶皮層（anterior cingulate cortex，ACC），尤其是其吻側(cè)部（rostral ACC，rACC）是參與情緒情感反應(yīng)的重要中樞[1-3]。已有研究證實(shí)，rACC也是傷害性刺激傳入高位中樞時(shí)形成痛厭惡情緒的重要腦區(qū)[4-6]，那么在痛情緒發(fā)生時(shí)rACC腦區(qū)神經(jīng)元釋放的神經(jīng)遞質(zhì)有何變化是我們所關(guān)注的。微透析技術(shù)正是一種可以探究這一問題的手段。該技術(shù)是將灌流取樣和透析技術(shù)結(jié)合起來并逐漸完善的一種從生物活體內(nèi)進(jìn)行動(dòng)態(tài)微量生化取樣的新技術(shù)，具有活體連續(xù)取樣、動(dòng)態(tài)觀察、定量分析、采樣量小、組織損傷輕等特點(diǎn)[7]。目前，微透析技術(shù)主要應(yīng)用于大腦、血液、脊髓等部位[8-11]，通過定位后取樣再檢測，觀察目標(biāo)神經(jīng)遞質(zhì)的相對變化，可在麻醉或清醒的生物體上使用。在清醒生物體上進(jìn)行微透析實(shí)驗(yàn)比起麻醉生物體，取得的樣本會(huì)更接近于正常生理狀態(tài)[12]。但由于動(dòng)物處于可自由活動(dòng)的狀態(tài)，存在很多不確定因素，因此實(shí)驗(yàn)中所需的條件和對動(dòng)物的各種操作均要在不斷地摸索和嘗試中確定。筆者通過查詢文獻(xiàn)并結(jié)合作者的實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)，介紹利用微透析技術(shù)進(jìn)行清醒大鼠rACC腦區(qū)定位取樣的方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 定位

1.1 微透析探針的選取 微透析探針的供應(yīng)商有瑞典的CMA公司，美國的BAS公司和日本的EICOM公司，另外也有實(shí)驗(yàn)室采用自制的微透析探針。本實(shí)驗(yàn)室采用的是EICOM公司的探針，根據(jù)定位腦區(qū)的深度和所需檢測的目標(biāo)神經(jīng)遞質(zhì)的分子量大小（一般檢測的神經(jīng)遞質(zhì)為氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)），選擇所需的探針規(guī)格。EICOM公司的腦組織探針主要有三個(gè)系列，本實(shí)驗(yàn)室選用的探針樣式為A-Z系列帶有導(dǎo)管、內(nèi)芯和導(dǎo)管配套的螺帽，探針規(guī)格為管長4 mm，膜長2 mm，膜材料：人造纖維素，50 kDa截留分子量，見圖1。

1.2 埋置導(dǎo)管定位手術(shù) 雄性SD大鼠，250～270 g，1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠（40～50 mg/kg）成功后，將其固定于腦立體定位儀上。切開頭皮，清除皮下筋膜，暴露顱骨，以前囟（Bregma）點(diǎn)為0點(diǎn)，根據(jù)Paxinos & Watson圖譜[13]rACC坐標(biāo)，AP：+2.6 mm，ML：±0.6 mm，DV：-2.8 mm，見圖2。將導(dǎo)管埋置于rACC定位標(biāo)記點(diǎn)，插入導(dǎo)管對應(yīng)的內(nèi)芯，擰上螺帽，后用牙托水泥固定。固定時(shí)應(yīng)注意將頭皮和牙托水泥接縫處分開，有助于膿血的滲出。術(shù)后3～5 d即可進(jìn)行微透析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后向取樣部位注入染料，病理切片觀察定位是否準(zhǔn)確。

2 基本原理

將帶有透析膜的探針定位于需采樣的生物體組織，用一種非常精密的注射泵進(jìn)行液體灌流，推送溶液至探針處，以達(dá)到與組織內(nèi)欲取出測量的低分子量物質(zhì)，進(jìn)行透析交換。交換后的透析液被采集，通過高效液相或其他儀器做進(jìn)一步的分析，見圖3。

3 取樣

3.1 取樣前準(zhǔn)備 溫度恒定24 ℃，灌流液選用復(fù)方氯化鈉溶液，因?yàn)槠鋚H值和滲透壓均和腦脊液相似，以此作為人工腦脊液進(jìn)行灌流，過濾器過濾后，備用。進(jìn)行取樣前連接好微透析泵、注射器、清醒活動(dòng)裝置、樣品低溫收集器等裝置。準(zhǔn)備1 mL的注射器，充滿三蒸水，固定于微透析泵上，打開微透析泵低速（1 μL/min），使微透析管道內(nèi)充滿三蒸水，以充分排出管內(nèi)氣體。

進(jìn)行探針檢測：用管路接頭和管路連接探針的入口與注射器針頭（長進(jìn)短出，黃進(jìn)藍(lán)出）；以低速（1 μL/min）向探針注射三蒸水，若整個(gè)探針膜表面有濕潤或“流淚”現(xiàn)象出現(xiàn)，則該探針正常，可以使用；若觀察到探針膜某處成股狀流出三蒸水，說明探針膜有破損或漏洞，應(yīng)更換探針。

3.2 清醒大鼠取樣 取樣裝置和取樣示意圖，如圖4、5所示，在取樣前應(yīng)先將大鼠放入裝置適應(yīng)15 min，以減少環(huán)境對動(dòng)物的新異刺激。開啟透析泵使灌流液充滿整個(gè)管路，然后將導(dǎo)管中的內(nèi)芯取出，裝備插入探針，插入探針前用三蒸水或人工腦脊液多次沖洗導(dǎo)管內(nèi)，防止導(dǎo)管內(nèi)有異物堵塞導(dǎo)管，損毀探針。使大鼠處于氣體麻醉狀態(tài)下，迅速插入并固定探針，將大鼠放回裝置待其清醒后，打開恒流注射泵開始灌流透析。用復(fù)方氯化鈉以2 μL/min的速度收集樣品，因?yàn)椴迦胩结槙r(shí)的刺激、微透析液中混有破碎細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)成分等都會(huì)對檢測結(jié)果造成一定的影響，所以開始取樣后60 min（平衡時(shí)間）透析液棄去不用，待目標(biāo)神經(jīng)遞質(zhì)檢測結(jié)果達(dá)到穩(wěn)定，便可定時(shí)收集樣本至-80 ℃保存。若收集的腦脊液用來測單胺類的神經(jīng)遞質(zhì)，則需在收集管中加入穩(wěn)定劑（穩(wěn)定劑：收集的腦脊液=1︰4）。穩(wěn)定劑配制方法：若配制100 mL穩(wěn)定劑：0.01 g Na2EDTA，220 μg抗壞血酸，0.6 mL無水乙酸，加水至100 mL。

收集樣本時(shí)除了要時(shí)刻觀察探針是否脫出外還應(yīng)注意每管收集液的體積是否大致相同，如出現(xiàn)明顯的差異則說明探針的透析膜出現(xiàn)損害或者微量泵出現(xiàn)偏差，應(yīng)立刻停止實(shí)驗(yàn)，確定問題出處后重新開始。另取樣速度和平衡時(shí)間的選擇要適當(dāng)，兩者成反比，當(dāng)速度過快時(shí)，平衡時(shí)間長，透析液中神經(jīng)遞質(zhì)含量過低。當(dāng)速度過慢時(shí)，平衡時(shí)間短，但不利于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

取樣方法成功的標(biāo)準(zhǔn)為：平衡時(shí)間后，每隔10分鐘連續(xù)收集三管透析液，能夠在透析液中檢測出目標(biāo)神經(jīng)遞質(zhì)的含量，并且?guī)状螜z測的數(shù)據(jù)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可認(rèn)為目標(biāo)神經(jīng)遞質(zhì)在平衡60 min后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)[14]。

4 取樣后管路和探針的清潔和保養(yǎng)

探針的清洗和保存：取樣結(jié)束后，立即取出探針，放入三蒸水中。將探針與管路連接，用1 μL/min的速度沖洗過夜，充分排出管路和探針中存留的鹽分后，取下探針，放入三蒸水中于4 ℃冰箱保存，用于防止探針透析膜收縮。若透析液體積和灌流液體積不一致，可能是探針被凝固的血液堵塞，可將探針置于胰蛋白液中，待可見物質(zhì)從探針膜端剝落即取出。

管路在沖洗完畢后，自然晾干，密封出入口，置于低溫條件保存，防止細(xì)菌滋生。

5 討論

微透析技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)、醫(yī)藥研究等領(lǐng)域已獲得越來越廣泛的應(yīng)用[15-20]?？梢杂糜趯?shí)時(shí)的神經(jīng)遞質(zhì)變化的檢測，不同于組織勻漿技術(shù)，不需要破壞機(jī)體的完整性，可維持在生理狀態(tài)下神經(jīng)遞質(zhì)檢測。微透析實(shí)驗(yàn)和其他很多實(shí)驗(yàn)不同，很多方面取決于操作者的技能水平[21]。本文通過筆者的實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)，介紹利用微透析技術(shù)進(jìn)行清醒大鼠rACC腦區(qū)定位取樣的技術(shù)要領(lǐng)。

在實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)注意：（1）探針的選擇要根據(jù)所檢測部位的定位深度和神經(jīng)遞質(zhì)分子量的大小，選擇所需的規(guī)格；（2）探針埋置定位要準(zhǔn)確，可根據(jù)腦圖譜（AP、ML、DV值）要準(zhǔn)確，微透析實(shí)驗(yàn)結(jié)束后要進(jìn)行病理切片觀察定位是否準(zhǔn)確；（3）在取樣前連接管路后，微注射器充滿三蒸水后，進(jìn)行灌流觀察管路是否有漏液或堵塞，同時(shí)檢測探針透析膜是否完好，是否可以使用；（4）插入探針前用三蒸水或人工腦脊液多次沖洗導(dǎo)管內(nèi)，防止導(dǎo)管內(nèi)有異物堵塞導(dǎo)管，損毀探針；（5）插入探針時(shí)，確定大鼠處于氣體麻醉狀態(tài)，插入探針時(shí)要特別注意不要損壞探針膜，延長探針的使用壽命和次數(shù)；

（6）取樣時(shí)要注意平衡時(shí)間和取樣速度的確定，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)要在收集管中加入穩(wěn)定劑；（7）取樣成功的標(biāo)準(zhǔn)為平衡時(shí)間后，每隔10分鐘連續(xù)收集三管透析液，能夠在透析液中檢測出目標(biāo)神經(jīng)遞質(zhì)的含量，并且?guī)状螜z測的數(shù)據(jù)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；（8）取樣后要注意管路和探針的清潔和保養(yǎng)，連接管路和探針，三蒸水低速灌流過夜，排出管路和探針中殘余的鹽分；（9）清潔完畢后，探針置于三蒸水中4 ℃冰箱保存，管路自然晾干，密封開口，低溫保存。

本文總結(jié)了筆者在進(jìn)行微透析實(shí)驗(yàn)時(shí)，定位和取樣以及取樣后探針的清潔與保存的操作方法，為類似的腦區(qū)定位微透析取樣實(shí)驗(yàn)提供方法依據(jù)。

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（收稿日期：2018-05-07） （本文編輯：程旭然）