陸國清 ，王春玲 ，郝宇瓊 ，郭惠明 ，黃英金 ，程紅梅 *

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌330045；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081）

棉花作為1種重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物，在全球被廣泛種植，但棉花整個(gè)生育期內(nèi)易受到各種生物和非生物因素的脅迫。其中，雜草直接與棉花爭水、爭肥、爭光照，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和質(zhì)量，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。隨著農(nóng)業(yè)勞動力價(jià)格的不斷提高，人工除草費(fèi)時(shí)費(fèi)力，以及田間管理的成本持續(xù)加大，這都提高了棉花種植和管理成本，生產(chǎn)實(shí)際中對高效、低毒和廣譜除草劑的需求更加迫切。草甘膦是1種內(nèi)吸性滅生型除草劑，能夠特異性的抑制植物中5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）的生物活性[2-3]，阻斷芳香族氨基酸的合成，擾亂植物的正常代謝而使植株死亡[4-5]。由于低殘留、易被分解、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，草甘膦被廣泛用于田間化學(xué)除草。草甘膦是目前市場上銷售量最大，使用最廣泛的化學(xué)除草劑[6-7]。利用草甘膦進(jìn)行雜草防治省時(shí)省力，但草甘膦屬于廣譜型除草劑，對綠色植物沒有選擇性，嚴(yán)重?fù)p害農(nóng)作物。因此要實(shí)現(xiàn)棉田的大面積化學(xué)除草，需要培育出抗草甘膦的新品種以滿足市場需求。

草甘膦被廣泛使用以來，科學(xué)家對抗草甘膦農(nóng)作物的研究不斷深入，而通過轉(zhuǎn)基因方式獲得草甘膦抗性農(nóng)作物仍然是目前最有效的途徑之一。自1987年獲得第1株轉(zhuǎn)基因棉花[8]，棉花的遺傳轉(zhuǎn)化研究就進(jìn)入飛速發(fā)展階段，抗蟲[9-10]、抗除草劑[11-12]轉(zhuǎn)基因棉花相繼問世?？钩輨┟藁ㄗ钤缬擅仙蕉脊狙芯坎⒃诿绹虡I(yè)化種植，而在國內(nèi)有關(guān)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花的報(bào)道雖然很多，都是處于實(shí)驗(yàn)研究階段，我國也一直未引進(jìn)美國的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花。因此，研究具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗草甘膦棉花新品種，為我國抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花的培育提供種質(zhì)資源。

基因工程可使農(nóng)作物直接獲得目的性狀，大大縮短育種年限，在農(nóng)業(yè)育種上的應(yīng)用已非常廣泛。G10基因來源于Deinococcus radiodurans R1，與EPSPS家族的ClassⅠ和ClassⅡ同源性很低，是1種新型的抗草甘膦EPSPS基因，具有較好的開發(fā)應(yīng)用潛力。研究表明在玉米[13]、大豆[14]中過表達(dá)EPSPS基因能有效提高作物的草甘膦抗性，其中轉(zhuǎn)基因玉米的草甘膦抗性水平和孟山都開發(fā)的抗性相同，具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的前景。本實(shí)驗(yàn)以棉花下胚軸作為材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將G10eve基因轉(zhuǎn)化棉花，獲得了抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因棉花。在高于田間使用濃度的草甘膦處理下，轉(zhuǎn)基因植株葉片未產(chǎn)生藥害，為培育高抗除草劑棉花品種提供了新的育種材料。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為常規(guī)陸地珂字棉312（Coker 312，文中簡稱 C312）。

G10基因是浙江大學(xué)克隆的抗草甘膦基因，對該基因進(jìn)行突變改良得到的基因命名為G10eve。轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌菌株為LBA4404，用于轉(zhuǎn)化的載體及質(zhì)粒由浙江大學(xué)沈志成教授提供，包含2個(gè)草甘膦抗性基因G10eve，分別由木薯葉脈花葉病毒 （Cassava vein mosaic virus，CsVMV）的PCVs啟動子和花椰菜花葉病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV）的35S啟動子表達(dá)，選擇標(biāo)記基因?yàn)镹PTⅡ，載體如圖1所示。植物DNA、RNA提取試劑盒購自于天根生化科技 （北京）有限公司。反轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR（Polymerase Chuin reaction）相關(guān)試劑盒購自于北京全式金生物技術(shù)有限公司。草甘膦購自美國孟山都公司（農(nóng)達(dá)，41%草甘膦異丙胺鹽水劑，馬來西亞）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)初步分析。將G10eve基因序列在https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進(jìn)行比對，并根據(jù)比對結(jié)果構(gòu)建進(jìn)化樹。將其氨基酸序列在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/w rpsb.cgi預(yù)測該基因的蛋白保守區(qū)，通過預(yù)測其蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)。

1.2.2 棉花的遺傳轉(zhuǎn)化。采用商品化培養(yǎng)基，操作步驟參照常規(guī)轉(zhuǎn)化方法[15]，以C312下胚軸為外植體，卡那霉素（Kanamycin，Kan）為篩選抗性，獲得轉(zhuǎn)基因再生植株。

圖1 G10eve基因載體示意圖Fig.1 Schematic of G10eve gene expression vector

轉(zhuǎn)化率（%）＝陽性胚性愈傷組織數(shù)/總胚性愈傷組織數(shù)×100%；

分化率 （%）＝分化出陽性苗胚性愈傷組織數(shù)/總胚性愈傷組織數(shù)×100%。

1.2.3 DNA提取及PCR分子檢測。利用DNA提取試劑盒，提取棉花胚性愈傷組織及再生T0和T1代棉花葉片總DNA。以質(zhì)粒為陽性對照，C312棉花總DNA為陰性對照，利用特異性引物G10F/G10R（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測目的基因是否整合到棉花基因組中。反應(yīng)程序?yàn)?4℃5 m in；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為452 bp。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像分析系統(tǒng)拍照并保存。

1.2.4 RNA提取及熒光定量RT-PCR分析。C312及T4轉(zhuǎn)基因植株，在幼苗期提取葉片總RNA，電泳檢測質(zhì)量后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)目的基因序列，設(shè)計(jì)熒光定量特異性引物Target-F/Target-R （表1）擴(kuò)增G10eve基因，UBQ-F/R（表1）為內(nèi)參基因引物。熒光定量RT-PCR按照試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃ 30 s； 94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在ABI 7500 real-time system（Applied Biosystems，美國）熒光定量PCR儀上進(jìn)行，3次重復(fù)，采用2－△△Ct方法進(jìn)行分析。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因棉花草甘膦篩選。在花盆中種植轉(zhuǎn)基因及對照組棉花，待棉花兩片子葉完全展開（兩葉一心期）時(shí)，分別用體積濃度 0、2、5、8 m L·L－1的草甘膦農(nóng)藥噴施棉花幼苗 （棉花大田推薦使用濃度為稀釋 200 倍，即 5 m L·L－1）。10 d 后觀察噴施草甘膦對植株的損傷情況，每種濃度處理1盆，每盆不少于10株植株。

1.2.6 莽草酸含量的測定。草甘膦處理72 h后采集葉片，根據(jù)鞏元勇等[16]方法提取并在380 nm下測定莽草酸的吸光值。每個(gè)樣品測定3次。

表1 引物序列Table 1 The sequence of primers

2 結(jié)果與分析

2.1 G10eve基因初步分子生物信息學(xué)分析

將G10eve基因核苷酸序列在NCBI中進(jìn)行比對分析，12條序列與其具有一定程度的同源性。在進(jìn)化樹中可以發(fā)現(xiàn)，其與現(xiàn)有的EPSPS基因同源性很低，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖2A）。對G10eve基因編碼的氨基酸進(jìn)行功能及保守區(qū)預(yù)測，結(jié)果表明其具有類似于EPSPS的功能保守結(jié)構(gòu)域，與草甘膦抗性基因aroA編碼的蛋白同源性較高（圖2B）。在NCBI-PDB中進(jìn)行比對，結(jié)果顯示G10eve與霍亂弧菌（Vibrio Cholerae）的 3-Phosphoshikimate 1-Carboxyvinyltransferase序列相似度最高 （E值：1.554E-36， 一致性：28%）。 通過Cn3D軟件分析可知，G10eve蛋白三維結(jié)構(gòu)含有11個(gè)α-螺旋和24個(gè)β-片層結(jié)構(gòu)（圖2C）。

2.2 抗草甘膦基因轉(zhuǎn)化棉花及植株再生

本研究以C312無菌苗下胚軸為外植體，農(nóng)桿菌浸染后，通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑，經(jīng)過抗性愈傷誘導(dǎo)、胚性愈傷誘導(dǎo)及植株再生獲得轉(zhuǎn)基因植株。利用50 mg·L－1Kan對下胚軸進(jìn)行抗性篩選，下胚軸在抗性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，兩端開始膨大，45 d后即可獲得大量愈傷組織。選取淺綠色或黃綠色愈傷組織進(jìn)行增殖培養(yǎng)，待抗性愈傷組織約1 cm3大小時(shí)，移至無外源激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)。根據(jù)愈傷組織狀態(tài)的不同，觀察質(zhì)地疏松、淡黃色的胚性愈傷的產(chǎn)生。在分化培養(yǎng)基上鋪墊濾紙，可減少三角瓶內(nèi)水珠凝聚，也有利于愈傷組織及胚狀體的繼代操作，最重要的是對胚性愈傷組織適度的脅迫誘導(dǎo)，有利于正常植株的再生。外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)后8個(gè)月，開始出現(xiàn)再生苗。本研究發(fā)現(xiàn)，對愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)長達(dá)2 a，仍可誘導(dǎo)出具有真葉的再生植株。

圖2 G10eve基因的生物信息學(xué)分析Fig.2 Bioinformatics analysis of G10eve gene

2.3 胚性組織及轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

2.3.1 胚性愈傷的PCR檢測。通過抗性愈傷組織篩選誘導(dǎo)，共獲得69個(gè)胚性愈傷系，經(jīng)PCR驗(yàn)證，其中34個(gè)為陽性的愈傷系，轉(zhuǎn)化率49.3%。圖3為部分獨(dú)立轉(zhuǎn)化愈傷系PCR檢測結(jié)果，初步確定通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，已將G10eve基因轉(zhuǎn)入到棉花材料中。

2.3.2 轉(zhuǎn)基因植株檢測。通過對胚性愈傷進(jìn)行分子檢測，及時(shí)處理掉未轉(zhuǎn)化成功的愈傷系，并對剩余陽性愈傷系進(jìn)行再生苗分化誘導(dǎo)。對嫁接成活的85棵棉花T0植株進(jìn)行PCR檢測，其中28個(gè)獨(dú)立愈傷系的59棵單株擴(kuò)增出目的條帶，再生植株陽性分化率為40.6%。圖4為部分轉(zhuǎn)基因嫁接苗檢測結(jié)果，初步證明目的基因已經(jīng)整合進(jìn)棉花基因組中。鑒定的陽性嫁接苗在溫室中繼續(xù)培養(yǎng)，直至種子成熟。最終共收獲12個(gè)愈傷系中的19棵陽性單株的種子。將陽性植株的部分種子種植在溫室中，對T1幼苗進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果表明：在19個(gè)植株中，有15株T1植株中能夠檢測到目的基因條帶，4個(gè)單株基因組DNA中未檢測到目的條帶。

2.3.3 轉(zhuǎn)基因棉花植株不同株系間G10eve基因相對表達(dá)量分析。選擇能夠穩(wěn)定遺傳的T4種子的L91、L152兩個(gè)株系進(jìn)行熒光定量PCR分析。結(jié)果表明，G10eve基因在這2個(gè)株系中能夠轉(zhuǎn)錄表達(dá)（圖5），且在2個(gè)株系中表達(dá)量差異明顯，L91株系中基因相對表達(dá)量約是L152株系中表達(dá)量的6.96倍。

圖3 轉(zhuǎn)基因愈傷系PCR鑒定Fig.3 PCR analysis of transgenic calli

圖4 轉(zhuǎn)基因嫁接植株P(guān)CR鑒定Fig.4 PCR analysis of transgenic grafted plants

圖5 G10eve基因在轉(zhuǎn)基因棉花株系中的表達(dá)分析Fig.5 The relative expression of G10eve gene in defferent lines of transgenic cotton

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的草甘膦檢測

為確定過表達(dá)G10eve基因的L91株系草甘膦抗性水平，采用盆栽實(shí)驗(yàn)，在子葉期噴施不同濃度的草甘膦（圖6）。在不噴施草甘膦的情況下，L91轉(zhuǎn)基因株系及受體C312棉花植株均可正常生長。噴施2 m L·L－1草甘膦農(nóng)藥10 d后，C312棉花生長受到抑制，生長點(diǎn)壞死，子葉邊緣有明顯枯斑，葉片失綠、萎蔫；而轉(zhuǎn)基因植株生長正常進(jìn)入兩葉期，且葉片無枯斑出現(xiàn)。5 m L·L－1草甘膦噴施處理后，對照C312植株生長點(diǎn)壞死，部分小苗已經(jīng)干枯死亡，藥害明顯；而轉(zhuǎn)基因棉花生長正常，未產(chǎn)生明顯枯斑，進(jìn)入真葉期。8 m L·L－1草甘膦噴施處理后，C312植株全部死亡；轉(zhuǎn)基因L91株系部分植株子葉出現(xiàn)枯斑，但植株整體綠色，能夠正常進(jìn)入兩葉期。根據(jù)草甘膦噴施實(shí)驗(yàn)，葉片對草甘膦的敏感程度及枯萎現(xiàn)象，可以確定過表達(dá)G10eve基因確實(shí)能夠提高棉花對草甘膦的抗性。

圖6 草甘膦處理10 d后對棉花葉片的影響Fig.6 The effect of glyphosate treatment after 10 days on cotton leaves

圖7 不同濃度草甘膦處理下棉花葉片莽草酸相對含量Fig.7 The relative contents of shikimic acid in cotton leaves with different glyphosate treatment

2.5 莽草酸含量的測定

莽草酸含量是判定植株對草甘膦抗性的重要生理指標(biāo)。2 m L·L－1草甘膦處理后，C312棉花植株葉片中莽草酸相對含量較正常生長條件下提高2倍左右；隨著草甘膦濃度的增加，C312葉片中莽草酸相對含量逐漸增加，8 m L·L－1草甘膦處理下，葉片中莽草酸相對含量最高（圖7）。而不同濃度的草甘膦處理轉(zhuǎn)基因陽性株系L91，L91葉片中莽草酸含量變化不大（圖7）。說明過表達(dá)G10eve轉(zhuǎn)基因植株具有草甘膦抗性，與噴施草甘膦的抗性表型一致。

3 討論與結(jié)論

目前，用于棉花遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有基因槍[17-18]、花粉管通道技術(shù)[19-20]和農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化[21-22]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法目前被大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用[23]。雖然棉花遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)比較成熟，但其轉(zhuǎn)化受菌株、受體基因型、激素、培養(yǎng)條件等多種因素限制[24-26]，流程比較復(fù)雜和困難，轉(zhuǎn)化周期長，導(dǎo)致很多實(shí)驗(yàn)室很難開展棉花遺傳轉(zhuǎn)化工作。本研究以C312為受體，使用商品化培養(yǎng)基，通過對愈傷及嫁接苗的檢測，轉(zhuǎn)化效率和分化效率可達(dá)到40%以上。商品化培養(yǎng)基在遺傳轉(zhuǎn)化中的有效使用，對程序化、標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；拿藁ㄟz傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供了有利條件。在棉花遺傳轉(zhuǎn)化過程中通過檢測愈傷，提前確定陽性愈傷系，可有效降低實(shí)驗(yàn)工作強(qiáng)度，有效提高繼代培養(yǎng)效率。胚性愈傷通常認(rèn)為來源于單細(xì)胞分化，體積小，可快速分裂并在短時(shí)間內(nèi)獲得大量材料，是1種比較理想的轉(zhuǎn)化受體材料[23]。以胚性愈傷為遺傳轉(zhuǎn)化受體材料，在海島棉[27]、陸地棉[28]中已經(jīng)應(yīng)用并成功獲得再生苗，有效的縮短了轉(zhuǎn)化周期。本研究發(fā)現(xiàn)，對胚性愈傷組織進(jìn)行再生誘導(dǎo)，在第8～24個(gè)月內(nèi)均可不斷獲得轉(zhuǎn)化植株，證明胚性愈傷潛在再生能力很強(qiáng)，這為開展以胚性愈傷為受體材料的棉花遺傳轉(zhuǎn)化工作提供了基礎(chǔ)。

草甘膦是滅生型除草劑，噴施后藥效明顯，見效快。近年，國外抗除草劑農(nóng)作物種植量逐年增加，而國內(nèi)研究相對滯后，缺乏競爭力。為滿足市場需求，加快獲得抗草甘膦的作物，培育具有自主知識產(chǎn)權(quán)的作物新品種迫在眉睫?？共莞熟⒒蛟谟N過程中不僅可以作為目標(biāo)性狀基因，也可以作為抗性篩選基因，而且更高效更安全，具有很高的研究價(jià)值。本研究在棉花中過表達(dá)草甘膦抗性基因G10eve獲得了大量陽性轉(zhuǎn)基因材料，為抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花的培育提供了種質(zhì)資源。外源基因在受體中的表達(dá)和自身繁殖后代過程中的穩(wěn)定遺傳直接影響轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)中在對T1植株進(jìn)行檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，G10eve基因在4株后代材料中未能檢測到陽性植株，這可能是因?yàn)門0植株在溫室中收獲的種子量偏少，有個(gè)別材料僅收獲到1粒種子，而外源基因在遺傳過程中發(fā)生分離，后代檢測樣本量不足所致；也可能是基因在傳代過程中丟失或表達(dá)沉默所致。外源基因的整合和遺傳比較復(fù)雜。外源基因可隨機(jī)插入到受體材料基因組中。基因插入位點(diǎn)的不同，甲基化、多拷貝、轉(zhuǎn)錄后共抑制等因素均可造成轉(zhuǎn)基因沉默或基因表達(dá)量下降[29-30]，這可能也是造成轉(zhuǎn)基因株系間G10eve基因表達(dá)量差異較大的原因，但具體原因需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，成功獲得了轉(zhuǎn)G10eve基因棉花，轉(zhuǎn)化效率和分化效率分別高達(dá)49.3%、40.6%。子葉期噴施不同濃度梯度草甘膦，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系植株獲得對草甘膦的抗性，可耐受 8 m L·L－1草甘膦。

[1]孟靈真,陳全家,楊婷,等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的bar基因和Bt基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,50(12):2189-2196.Meng Lingzhen,Chen Quanjia,Yang Ting,et al.Studies on genetic transformation of Agrobacterium-mediated bar gene and Bt gene[J].Xinjiang Agricultural Sciences,2013,50(12):2189-2196.

[2]Am rhein N,Deus B,Gehrke P,et al.The site of the inhibition of the shikimate pathway by glyphosate:II.Interference of glyphosate with chorismate formation in vivo and in vitro[J].Plant Physiology,1980,66(5):830-834.

[3]Woodburn A T.Glyphosate:Production,pricing and use worldw ide[J].Pest Management Science,2000,56(4):309-312.

[4]Duke S O,Pow les S B.Glyphosate:A once-in-a-century herbicide[J].Pest Management Science,2008,64(4):319-325.

[5]Tan S,Evans R,Singh B.Herbicidal inhibitors of amino acid biosynthesis and herbicide-tolerant crops[J].Am ino Acids,2006,30(2):195-204.

[6]Beckie H J.Herbicide-resistant weed management:Focus on glyphosate[J].Pest Management Science.2011,67(9),1037-1048.

[7]陳世國,強(qiáng)勝,毛嬋娟.草甘膦作用機(jī)制和抗性研究進(jìn)展[J].植物保護(hù),2017,43(2):17-24.Chen Shiguo,Qiang Sheng,Mao Chanjuan.Mechanism of action of glyphosate and research advances in glyphosate resistance[J].Plant Protection,2017,43(2):17-24.

[8]Umbeck P,Johnson G,Barton K,et al.Genetically transformed cotton(Gossypium hirsutum L.)plants[J].Nature Biotechnology,1987,5(3):263-266.

[9]Perlak F J,Deaton R W,Armstrong T A,et al.Insect resistant cotton plants[J].Nature Biotechnology,1990,8(10):939-943.

[10]Thomas J C,Adams D G,Keppenne V D,et al.Protease inhibitors of manduca sexta expressed in transgenic cotton[J].Plant Cell Reports,1995,14(12):758-762.

[11]Bayley C,Trolinder N,Ray C,et al.Engineering 2,4-D resistance into cotton[J].Theoretical and Applied Genetics,1992,83(5):645-649.

[12]Keller G,Spatola L,M ccabe D,et al.Transgenic cotton resistant to herbicide bialophos[J].Transgenic Research,1997,6(6):385-392.

[13]李京.新型轉(zhuǎn)基因抗草甘膦玉米的培育及轉(zhuǎn)基因玉米安全控制技術(shù)的研究[D].杭州:浙江大學(xué),2013.Li Jing.Research on the novel glyphosate-resistant corn and the selectively term inable strategy[D].Hangzhou:Zhejiang University,2013.

[14]譚苗苗.轉(zhuǎn)g10evo基因抗草甘膦大豆的研究[D].杭州:浙江大學(xué),2016.Tan Miaom iao.The study of g10evo glyphosate-resistant transgenic soybean[D].Hangzhou:Zhejiang University,2016.

[15]李燕娥,朱楨,陳志賢,等.豇豆胰蛋白酶抑制劑轉(zhuǎn)基因棉花的獲得[J].棉花學(xué)報(bào),1998,10(5):237-243.Li Yan’e,Zhu Zhen,Chen Zhixian,et al.Obtaining transgenic cotton plants with cow pea trypsin inhibitor gene[J].Acta Gossypii Sinica, 1998, 10(5): 237-243.

[16]鞏元勇,郭書巧,束紅梅,等.1株抗草甘膦棉花突變體草甘膦抗性的初步鑒定[J].棉花學(xué)報(bào),2014,26(1):18-24.Gong Yuanyong,Guo Shuqiao,Shu Hongmei,et al.Prelim inary identification of glyphosate resistance of a new cotton mutant[J].Cotton Science,2014,26(1):18-24.

[17]M ccabe D E,Martinell B J.Transformation of elite cotton cultivars via particle bombardment of meristems[J].Nature Biotechnology,1993,11(5):596-598.

[18]Zapata C,Park S H,EIzik K M,et al.Transformation of a Texas cotton cultivar by using Agrobacterium and the shoot apex[J].Theoretical and Applied Genetics,1999,98(2):252-256.

[19]劉錫娟,劉昱輝,王志興,等.轉(zhuǎn)5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）基因抗草甘膦煙草和棉花的獲得[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2007,15(6):958-963.Liu Xijuan,Liu Yuhui,Wang Zhixing,et al.Generation of glyphosate-tolerant transgenic tobacco and cotton by transformation with a 5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase(EPSPS)gene[J].Journal of Agricultural Biotechnology,2007,15(6):958-963.

[20]燕樹鋒,祝水金,劉海芳,等.轉(zhuǎn)EPSPS基因抗草甘膦棉花的遺傳分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2015,30(3):54-57.Yan Shufeng,Zhu Shuijin,Liu Haifang,et al.Genetic analysis of transgenic glyphosate resistance cotton with EPSPS gene[J].Acta Agriculturae Boreali-Sinica,2015,30(3):54-57.

[21]Gould J H,Magallanes-Cedeno M.Adaptation of cotton shoot apex culture to Agrobacterium-mediated transformation[J].Plant Molecular Biology Reporter,1998,16(3):1-10.

[22]Jin Shuangxia,Zhang Xianlong,Nie Yichun,et al.Identification of a novel elite genotype for in vitro culture and genetic transformation of cotton[J].Biologia Plantarum,2006,50(4):519-524.

[23]Jin Shuangxia,Zhang Xianlong,Liang Shaoguang,et al.Factors affecting transformation efficiency of embryogenic callus of upland cotton(Gossypium hirsutum)with Agrobacterium tumefaciens[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2005,81(2):229-237.

[24]Sunilkumar G,Rathore K S.Transgenic cotton:Factors influencing Agrobacterium-mediated transformation and regeneration[J].Molecular Breeding,2001,8(1):37-52.

[25]孫英坤,代其林,龔元亞,等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化過程中諸因素對出愈率的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2012,49(2):431-435.Sun Yingkun,Dai Qilin,Gong Yuanya,et al.Effects of some factors on callus rate in the process of cotton genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens[J].Journal of Sichuan University(Natural Science Edition),2012,49(2):431-435.

[26]羅曉麗,吳家和,肖娟麗,等.非珂字棉系統(tǒng)陸地棉的轉(zhuǎn)化效率[J].棉花學(xué)報(bào),2002,14(6):365-367.Luo Xiaoli,Wu Jiahe,Xiao Juanli,et al.Transformed efficiency of non-Coker upland cotton(Gossypium hirsutum L.)cultivars[J].Cotton Science,2002,14(6):365-367.

[27]周麗容,陳全家,賀雅婷,等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)海島棉胚性愈傷高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,34(4):317-320.Zhou Lirong,Chen Quanjia,He Yating,et al.Research on high efficient genetic transformation system of agrobacterium Gossypium barbadense L.embryogenic calli[J].Journal of Xinjiang Agricultural University,2011,34(4):317-320.

[28]謝德意,金雙俠,郭小平,等.棉花胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因胚狀體的有效萌發(fā)與成苗技術(shù)研究[J].作物學(xué)報(bào),2007,33(5):751-786.Xie Deyi,Jin Shuangxia,Guo Xiaoping,et al.Genetic transformation of cotton with embryogenic calli as explants and efficient transgenic somatic embryoid germ ination and plant recovery[J].Acta Agronom ica Sinica,2007,33(5):751-786.

[29]夏蘭芹,王遠(yuǎn),郭三堆.外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)與穩(wěn)定性[J].生物技術(shù)通報(bào),2000(3):8-12.Xia Lanqin,Wang Yuan,Guo Sandui.The stability of the expression of foreign genes in transgenic plants[J].Biotechnology Information,2000(3):8-12.

[30]吳才君,范淑英.植物轉(zhuǎn)基因沉默[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,26(1):154-158.Wu Caijun,Fan Shuying.Gene silence in transgenic plants[J].Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis,2004,26(1):154-158.