崔偉業(yè)，周雷，單柳穎，張君，戴小楓，郭維

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193）

大麗輪枝菌（Verticillium dahliae K leb.）屬于半知菌類輪枝孢屬真菌，寄主范圍極廣，可引起200多種雙子葉植物的黃萎病；由其引起的棉花黃萎病是制約我國棉花生產(chǎn)的主要因素之一[1-2]。雖然目前棉花黃萎病的侵染過程比較清楚，土壤中存活的微菌核或分生孢子受到棉花根系分泌物的刺激后萌發(fā)產(chǎn)生菌絲侵染寄主的根部，然后進入維管組織破壞寄主水分運輸，產(chǎn)生萎蔫和維管束褪綠褐化等癥狀[3]；但是由于大麗輪枝菌的微菌核在土壤中存活時間長、抗病育種滯后、缺乏環(huán)境友好且防治效果好的殺菌劑等因素導致目前尚無有效的防治手段[4-8]。因此，研究大麗輪枝菌的致病機理是制定防治策略的基礎性工作。

遺傳轉(zhuǎn)化技術的發(fā)展為深入研究基因功能提供了強有力的工具，自1973年M ishra和Tatum首次成功實現(xiàn)粗糙脈孢菌的遺傳轉(zhuǎn)化以來[9]，目前已通過PEG介導的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化（Polyethylene glycol-mediated protoplast transformation）、轉(zhuǎn)座子介導的遺傳轉(zhuǎn)化（Transposon-mediated transformation）、限制性內(nèi)切酶介導的遺傳轉(zhuǎn)化（Restriction enzyme mediated integration,REM I）和農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化 （Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT） 等技術對100多種絲狀真菌實現(xiàn)了遺傳轉(zhuǎn)化[10-11]。以ATMT為基礎的T-DNA突變體庫的開發(fā)與應用已經(jīng)成為鑒定和分析致病相關基因的有效途徑之一。目前通過對大麗輪枝菌的T-DNA突變體庫篩選已經(jīng)獲得了一些致病相關基因的信息，如：VdEg1（Endoglucanase 1）、VdHMGS （Hydroxyl-methyl glutaryl-CoAsynthase）、VdMFS1（Major facilitator superfamily 1） 和 VdCYP1 （Cytochrome P450 monooxygenase 1）等[12-14]。

本研究以本實驗室建立的強致病力落葉型大麗輪枝菌Vd991的T-DNA突變體庫為基礎[15]，從中隨機選取了294個轉(zhuǎn)化子進行致病力測定，經(jīng)過2輪篩選共獲得了9個致病缺陷型突變體。初步明確了這些突變體的生物學性狀和插入位點側(cè)翼序列特征，為大麗輪枝菌致病機理研究提供了候選基因。

1 材料和方法

1.1 菌株的活化和培養(yǎng)

落葉型大麗輪枝菌菌株Vd991的T-DNA插入突變體初次活化采用王新艷等[16]的方法，分離單孢后在培養(yǎng)瓶中25℃避光培養(yǎng)7 d并保存甘油菌。初步篩選到致病力下降的突變體后，將候選突變體和野生型 Vd991 在含有 50 μg·m L－1卡那霉素和 100 μg·m L－1氨芐青霉素的 PDA 培養(yǎng)基上再次活化，25℃恒溫避光培養(yǎng)7 d。在菌落生長邊緣處取直徑5 mm菌碟接種于查比克液體培養(yǎng)基中，180 r·m in－1，25 ℃，避光恒溫搖床培養(yǎng) 7 d。用四層無菌紗布過濾孢子，調(diào)節(jié)孢子濃度至1×107m L－1備用。過濾后的菌絲用錫箔紙包裹后置于－80℃冰箱保存，用于提取基因組DNA。

1.2 菌株致病力測定

初次致病力篩選參考王新艷等[16]的大麗輪枝菌致病性相關突變體快速篩選方法，在培養(yǎng)瓶中加入20 m L無菌水，洗脫孢子，準備孢子懸浮液。以野生型菌株Vd991為對照，采用蘸根接菌法將大麗輪枝菌接種到感病陸地棉品種軍棉1號的根部，20 d后觀察統(tǒng)計發(fā)病情況。在初步篩選獲得致病力下降突變體的基礎上再采用朱荷琴等[17]的蛭石沙土無底紙缽定量接種菌液的方法，每個突變體分別接種16株棉花用于病情指數(shù)調(diào)查，以野生型菌株Vd991和H2O為對照，在棉花第1片真葉完全展開時每株棉花接種20 m L濃度為1×107m L－1的孢子懸浮液。接菌后每天觀察統(tǒng)計1次病情指數(shù)。病情指數(shù)=100×∑（各級病株數(shù)×相應病級）/（調(diào)查總樣本數(shù)×最高病級）。棉花感染大麗輪枝菌后病級的劃分標準為：0級：子葉和真葉無病狀；1級：1至2片子葉發(fā)病；2級：2片子葉和1片真葉發(fā)??；3級：子葉和2片及2片以下真葉發(fā)病；4級：3片及3片以上真葉發(fā)病。接種后棉花的病情指數(shù)用SPSS 17.0進行分析。

1.3 菌株生物學特性測定

1.3.1 菌株生長速率測定。取Vd991和突變體分別接種至CM培養(yǎng)基[18]上活化，25℃恒溫避光培養(yǎng)15 d后，用直徑為5 mm的打孔器在菌落邊緣處取菌碟再次置于9cm的CM培養(yǎng)基中央。25℃避光培養(yǎng)10 d后觀察菌落形態(tài)和測量菌落直徑大小。每個菌株設置5個重復。

1.3.2 菌株產(chǎn)孢量測定。分別取Vd991和突變體的2粒菌碟接種至25 m L查比克液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后收集不同菌株的分生孢子，用無菌水調(diào)節(jié)孢子濃度至1×106m L－1，然后取1 μL接種于 50 m L 查比克液體培養(yǎng)基，180 r·m in－1，25 ℃避光恒溫搖床培養(yǎng)5 d后用血球計數(shù)板測定孢子產(chǎn)量。每個菌株設3次重復，菌株的產(chǎn)孢量取3次重復的平均值。

圖1軍棉1號接種大麗輪枝菌野生型Vd991，致病缺陷型突變體和水（陰性對照）后第25天的癥狀Fig.1 Sympotoms of G.hirsutum cv.Junmian 1 innoculated with Vd991,pathogeniciy defective T-DNA mutants and H2O(negative control)at 25 days post-inoculation

1.4 致病缺陷型突變體的分子驗證

1.4.1 潮霉素抗性標記的PCR檢測。采用CTAB法[6]提取不同菌株的基因組DNA。以Vd991為對照，通過 PCR（Polymerase chain reaction）擴增檢測突變體中是否含有潮霉素抗性基因（Hygromycin gene,Hyg），擴增引物為HygF和HygR（表1）。PCR反應條件為95℃預變性5 min，95℃變性 30 s，55 ℃復性 30 s，72 ℃延伸 2 m in，共30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃繼續(xù)延伸10 m in。

1.4.2 T-DNA插入拷貝數(shù)檢測。取野生型Vd991和其它突變體基因組DNA 30 μg，分別用Bam HI 37℃單酶切過夜。酶切完后加入20 μL 10 mM的EDTA溶液終止反應并將DNA抽提濃縮至30 μL后進行電泳。探針為隨機標記的Hyg片段。Southern雜交具體步驟參照Roche試劑盒提供的方法進行。

1.5 致病缺陷型突變體T-DNA插入位點側(cè)翼序列的克隆與分析

利 用 hiTAIL-PCR （high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR）方法用兼并引物LAD1，LAD2，LAD3，LAD4，LAD5 和特異引物 RB1 進行第一輪PCR（表1），隨后取第一輪PCR產(chǎn)物為模板，特異引物AC1和RB2進行第二輪PCR，最后以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，特異引物RB3和AC1進行第三輪PCR。擴增得到插入T-DNA片段的RB（Right boder）端與大麗輪枝菌基因組之間的鄰接序列。hiTAIL-PCR參考劉耀光等[19]的方法進行，回收第3輪500～1 000 bp的PCR產(chǎn)物，并將其克隆至pEASY-T1 Simple載體（北京全式金生物技術有限公司）后測序。測序結(jié)果與Ensembl基因組數(shù)據(jù)庫中在線共享的大麗輪枝菌VdLs.17的基因組數(shù)據(jù)庫（http://fungi.ensembl.org/Verticillium_dahliae/Info/Index）進行Blast比對分析，確定T-DNA插入位點的序列信息。

1.6 致病相關基因的克隆

根據(jù)VdLs.17基因組的序列信息，設計所鑒定的致病相關基因的特異引物 （表1）。然后從Vd991基因組中擴增致病相關基因。反應條件為95℃預變性 5min，95℃變性 30 s，55℃復性 30 s，72℃延伸4 m in，共30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 m in。

1.7 數(shù)據(jù)分析工具

采用 M icrosoft Office Excel 2010，SigmaPlot 12.5和SPSS 17.0等軟件分析致病缺陷型突變體的生長速率、產(chǎn)孢量和病情指數(shù)等。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病缺陷型突變體的篩選

294個大麗輪枝菌的T-DNA插入突變體經(jīng)過2輪致病力篩選，共有9個突變體接種棉花

25 d后的病癥表現(xiàn)與接種野生型的棉花相比明顯減弱（圖1）。病情指數(shù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)接種這些突變體的棉花的病情指數(shù)與野生型接種的棉花相比極顯著下降（P＜0.01）；其中突變體M 11H11的病指下降幅度最明顯，與野生型相比下降了32.26%，突變體M 12A11的病指下降幅度最小，相對野生型下降了9.68%，其余突變體的病指與野生型的病指相比都有不同程度的下降 （表2）；表明這9個突變體在寄主棉花上的致病力與野生型相比均明顯降低。

表1本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

表2致病缺陷型突變體致病性鑒定Table 2 Analysis of virulence of pathogenicity defective mutants

2.2 致病缺陷型突變體的分子檢測

利用引物HygF和HygR對9個突變體和野生型Vd991中潮霉素基因進行檢測，結(jié)果表明在所有突變體中均可以擴增出1 026 bp的潮霉素片段，而在野生型中則未能擴增到目的片段（圖2A）。Southern雜交結(jié)果顯示9個突變體中的T-DNA均已整合插入到大麗輪枝菌的基因組中。除M 11D07的T-DNA為2個拷貝插入以外，其余的均為單拷貝插入（圖2B）。

圖2突變體中潮霉素基因以及T-DNA插入拷貝數(shù)的檢測Fig.2 Analysis of Hyg gene and T-DNA copy number in the Vd991 and pathogeniciy defective T-DNA mutants

2.3 致病缺陷型突變體的生物學表型分析

和野生型Vd991相比，突變體菌株在營養(yǎng)比較豐富的CM培養(yǎng)基上菌落生長速率發(fā)生了不同程度的變化。菌落形態(tài)觀察和生長速率測定結(jié)果表明與野生型Vd991每天的生長速率（3.49±0.42 mm）相比，突變體 M 12A11、M 12B05、M 12H01、M 13E01和M 13H10的生長速率極顯著下降；其中M 13E01生長速率最慢，與野生型相比下降約29.7%；而突變體M 11H11、M 11D07、M 12B10和M 13H08的生長速率與野生型差異不顯著（圖3A和3B）。

產(chǎn)孢量測定結(jié)果表明與野生型相比，突變體M 11H11，M 13H10，M 12H01 和 M 12A11 的 產(chǎn) 孢量極顯著下降，分別下降了70.5%，53.6%，48.8%和39.2%；但是突變體M 11D07和M 13E01的產(chǎn)孢量與野生型相比分別提高了55.8%和44.2%，差異顯著（圖3C）。這表明T-DNA插入不同程度地影響了突變體的生長速率和產(chǎn)孢能力。

圖3野生型Vd991與致病缺陷型突變體的菌落形態(tài)、生長速率和產(chǎn)孢量比較分析Fig.3 Com parison of colonial morphology,grow th rate and conidia production between Vd991 and pathogeniciy defective T-DNA mutants.

2.4 致病缺陷型突變體的T-DNA插入位點側(cè)翼序列分析

將通過hiTAIL-PCR得到的RB側(cè)翼序列與VdLs.17的基因組數(shù)據(jù)進行比對分析得到9個突變體中T-DNA插入位點的側(cè)翼序列信息，其中M 12A11，M 12B10和 M 13H08的 T-DNA RB 右端均缺失1個A（圖4）。另外，從表3中發(fā)現(xiàn)有4個突變體的T-DNA插在基因的編碼區(qū)；3個突變體的T-DNA插在基因上游300 bp以內(nèi)的啟動子區(qū)；2個突變體的T-DNA插在基因下游300 bp以內(nèi)的終止子區(qū)，其中突變體M 11D07為2個拷貝；沒有T-DNA插在內(nèi)含子區(qū)的突變體。這些插在基因啟動子區(qū)和終止子區(qū)的突變體有可能影響這些基因的表達而導致突變體的致病力下降。從T-DNA插入位點來看，10個插入位點分布在大麗輪枝菌5條染色體上（表3），表明構(gòu)建的大麗輪枝菌T-DNA插入突變體庫具有很好的隨機性，可以在全基因組范圍內(nèi)實現(xiàn)大規(guī)模的基因功能篩選與鑒定。

圖4 T-DNA插入位點右邊界序列分析Fig.4 Alignment of the RB sequences at the junction of T-DNA integration site of V.dahliae mutants

2.5 致病相關基因的克隆與分析

根據(jù)VdLs.17的基因組信息，設計表3中鑒定到的致病相關基因的特異引物在野生型Vd991中克隆相應的基因序列。序列分析結(jié)果顯示Vd991中與VdLs.17中這10個致病相關基因的序列相似性為 97%～100%； 其中VDAG_00134和VDAG_03916這2個基因的序列在Vd991與VdLs.17中序列完全相同；而其它基因的差異主要體現(xiàn)在單堿基的突變和缺失。依據(jù)VdLs.17的功能注釋，這10個基因可以分為3類：第一類是編碼功能未知蛋白的5個基因；第二類是編碼預測定位于細胞核的參與細胞功能調(diào)節(jié)的基因，包括編碼SUA5蛋白的VDAG_04094， 編 碼 Mago nashi蛋 白 的VDAG_07829和編碼DNA修復相關核酸外切酶rad1的VDAG_01087；第三類是編碼參與碳水化合物或脂酶代謝的基因，如編碼β-葡糖苷酶的VDAG_00134和編碼vacuole morphology and inheritance protein 的 VDAG_09430（表 3）。

3 討論

大麗輪枝菌VdLs.17和JR2菌株的全基因組測序和注釋信息的公布極大的促進了該菌致病相關基因的研究工作。利用T-DNA突變體插入位點的側(cè)翼序列與這2個菌株的全基因組序列進行比對可以快速獲得T-DNA在基因組上的插入位置和相關基因的信息，加速了功能基因的驗證進程，有利于進一步闡明大麗輪枝菌的致病分子機理。

雖然利用T-DNA突變體庫來篩選鑒定大麗輪枝菌的致病相關基因已有不少報道，如劉義杰等[20]從800個突變體中篩選到25個致病力顯著下降的單拷貝插入的T-DNA突變體。谷素靜等[21]篩選到3個致病力顯著下降的突變體，其中2個突變體的微菌核產(chǎn)生嚴重受阻。但是本研究獲得的致病相關基因與已報道的基因均不同，屬于新發(fā)現(xiàn)的致病相關基因。通過與已公布的大麗輪枝菌基因組信息進行比對，發(fā)現(xiàn)只有5個基因有相關的注釋信息。其中突變體M 11H11破壞的VDAG_09430基因編碼1個參與囊泡形成的蛋白，可能參與磷酸肌醇信號轉(zhuǎn)導途徑的調(diào)控[22]。M 12B05突變體中T-DNA位于VDAG_04094基因上游的啟動子區(qū)，可能影響該基因的正常表達。VDAG_04094編碼1個SUA5蛋白，它在酵母中的同源蛋白可以通過結(jié)合dsRNA影響核糖體的翻譯并影響酵母的正常生長。突變體M 13H08可能影響了VDAG_01087基因的正常表達，該基因編碼DNA修復相關核酸外切酶rad1，其在酵母中的同源蛋白在細胞的減數(shù)分裂過程中發(fā)揮重要作用。突變體M 11D07可能影響了VDAG_00134基因的正常表達，該基因編碼1個具有分泌信號肽的葡聚糖苷酶，推測其可能在大麗輪枝菌侵入早期降解寄主細胞壁的過程中發(fā)揮作用；但是由于該突變體的T-DNA是雙拷貝插入，所以該突變體在棉花上的致病力降低是由1個基因引起的還是2個基因同時作用的結(jié)果還需要進一步通過敲除互補實驗來驗證。

就T-DNA的插入位置而言，本研究中獲得的 突 變 體 M 12B05，M 13H08和 M 13H10的T-DNA都是插在了3個基因上游的啟動子區(qū)，可能間接導致了T-DNA插入點下游的基因不能正常轉(zhuǎn)錄；而突變體M 11D07和M 13E01的T-DNA可能破壞了相關基因3′端的非編碼區(qū)從而間接影響T-DNA插入點上游基因的正常轉(zhuǎn)錄或者翻譯過程；其余突變體的T-DNA則插在了相關基因的外顯子上，直接破壞了相應基因的正常表達。就T-DNA的插入位點分布而言，9個致病缺陷型突變體的T-DNA的插入位點隨機分布于大麗輪枝菌8條染色體中的5條。

表3致病缺陷型T-DNA突變體插入位點側(cè)翼序列分析Table 3 Sequence analysis of T-DNA flanking regions of V.dahliae pathogenicity defective mutants

4 結(jié)論

由于T-DNA插入的隨機性，通過對大麗輪枝菌致病缺陷性T-DNA突變體的篩選和側(cè)翼序列分析使得在基因組范圍內(nèi)大規(guī)模的開展大麗輪枝菌致病相關基因的功能研究成為了可能，極大的促進了大麗輪枝菌的致病分子機制等研究，為進一步培育抗病棉花品種奠定了基礎。

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