石志芳，張曉靜，席 磊，程 璞

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 a 動物科技學(xué)院，b 生物工程學(xué)院，c 自動化學(xué)院，河南 鄭州 450046)

隨著集約化規(guī)?；怆u養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，雞群高度集中，各類疾病傳播途徑縮短，疾病流行出現(xiàn)了新的規(guī)律，表現(xiàn)為雞群呼吸道疾病的發(fā)生與雞舍內(nèi)致病微生物數(shù)量和分布特征緊密相關(guān)[1-2]。養(yǎng)殖環(huán)境中存在大量致病微生物，如沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等，這些微生物附著于雞舍空氣中，極易對飼料、飲水和養(yǎng)殖設(shè)施表面等造成污染，雞群通過采食和飲水等環(huán)節(jié)可感染致病菌，帶菌雞群通過呼吸和排泄過程又會引起舍內(nèi)微生物污染進(jìn)一步加重。目前，國內(nèi)外對畜禽舍內(nèi)微生物的研究主要集中在舍內(nèi)環(huán)境微生物的數(shù)量及其種類鑒定方面[3-5]，但對于肉雞舍在飼養(yǎng)期間的舍內(nèi)空氣環(huán)境微生物數(shù)量及其分布特征罕見報道。因此，本研究旨在通過對肉雞飼養(yǎng)期間舍內(nèi)微生物數(shù)量進(jìn)行檢測，探討分析肉雞舍主要致病微生物種類及其分布規(guī)律，從而對肉雞舍的環(huán)境狀況做出客觀評估，為集約化肉雞生產(chǎn)環(huán)境調(diào)控與疾病防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗雞場概況

于2016年1月26日至2月14日，在河南鶴壁某規(guī)?；怆u養(yǎng)殖場內(nèi)進(jìn)行試驗。試驗雞場距離公路560 m，周圍1 000 m范圍內(nèi)無其他空氣污染源。場內(nèi)有3棟雞舍，均為全封閉無窗式結(jié)構(gòu)，長132 m，寬18 m。采用地面墊料平養(yǎng)模式飼養(yǎng)白羽肉雞，墊料為稻殼，厚度20 cm，全自動料線水線，自由采食，自由飲水。采用LED燈帶采光，光照時間為23 h(光)/1 h(暗)。雞舍為縱向機(jī)械通風(fēng)，因是冬季，故風(fēng)機(jī)每5 min為一個運(yùn)轉(zhuǎn)周期，3周齡前風(fēng)機(jī)運(yùn)行1 min，停4 min；3周齡后風(fēng)機(jī)運(yùn)行1.5 min，停 3.5 min。雞舍屋檐下設(shè)有應(yīng)急通風(fēng)窗。3棟雞舍內(nèi)均分別飼養(yǎng)3萬只肉雞。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 營養(yǎng)瓊脂(NA)和麥康凱培養(yǎng)基(MAC)由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；SS瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基(BAP)和沙氏瓊脂(SDA)由北京三藥技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)。

1.2.2 主要儀器 GASTiger2000型NH3和CO2便攜式測量儀，深圳萬安迪科技有限公司；FLY-3R25型大氣粉塵采樣器，北京宏昌信儀器設(shè)備公司；LGR-WSD20型溫濕度記錄儀，杭州路格科技有限公司；303A-4型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，上海榮豐科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 肉雞舍環(huán)境參數(shù)測定 雞舍內(nèi)溫度、濕度采用LGR-WSD20型溫濕度記錄儀測定；NH3和CO2濃度采用GASTiger2000型便攜式測量儀每5 min測定記錄一次，傳感器布置在距地面15 cm處。粉塵濃度利用FLY-3R25型大氣粉塵采樣器進(jìn)行測定，采樣時間為30 min。

1.3.2 空氣中微生物樣品采集 在雞舍內(nèi)每個采樣高度上均勻布設(shè)15個采樣點，即沿雞舍縱向布置3列采樣點，左右兩列采樣點分別距離雞舍兩縱墻1 m，距離中間列采樣點各為6 m，每列分別均勻布置5個采樣點，各點之間均相距22 m(圖1)。分別在每個采樣點處距墊料表面0，15和160 cm處以平板自然沉降法采集空氣中微生物[6]。在肉雞7日齡、17日齡和27日齡采樣，同時對雞舍內(nèi)溫濕度和粉塵、NH3、CO2含量進(jìn)行監(jiān)測記錄。

圖1 本試驗中雞舍空氣微生物采樣點布設(shè)示意圖Fig.1 Layout of sampling sites of tested broiler house

1.3.3 設(shè)施表面微生物樣品采集 采用擦拭法采集鐵質(zhì)料線、墻面、塑料水線以及應(yīng)急窗玻璃等設(shè)施表面微生物[7]，即戴上無菌手套用棉簽蘸取生理鹽水后在上述采樣設(shè)施表面來回擦拭20次，將棉簽頭折斷放回試管內(nèi)，浸沒在生理鹽水中，密封保存，帶回實驗室備用。隨機(jī)采集墊料表面樣品(質(zhì)量≥10 g)，裝入無菌袋，封口保存，帶回實驗室備用。

1.3.4 樣品處理菌落計數(shù) 將1.3.2節(jié)采集的空氣中微生物置于平板培養(yǎng)皿中37 ℃下倒置培養(yǎng)24 h，對每個平板上的菌落進(jìn)行計數(shù)，按下式計算空氣中微生物總菌落數(shù)(CFU/m3)。

空氣中微生物總菌落數(shù)=50 000N/A×T。

式中：N為每個培養(yǎng)皿內(nèi)菌落數(shù)，CFU；A為培養(yǎng)皿面積，cm2；T為采樣時間，min。

將1.3.3節(jié)采集的微生物樣品菌懸液用生理鹽水分別做10倍梯度稀釋，接種到平板計數(shù)瓊脂(PCA)培養(yǎng)基上，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，對每個平板上的菌落數(shù)進(jìn)行人工計數(shù)。按下式計算設(shè)施表面微生物總菌落數(shù)(CFU/cm2)。

P=50N10X/S。

式中：P為設(shè)施表面微生物總菌落數(shù)，CFU/cm2；N為每個培養(yǎng)皿內(nèi)菌落數(shù)，CFU；X為稀釋倍數(shù)；S為采樣面積，cm2。

1.3.5 微生物種類鑒定 雞舍內(nèi)主要微生物菌群及其專用培養(yǎng)基見表1。采用平板劃線法和涂抹法分別接種培養(yǎng)基，接種后的培養(yǎng)基倒置放在37 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h，分別取營養(yǎng)瓊脂(NA)、麥康凱瓊脂(MAC)、SS瓊脂、血瓊脂(BAP)和沙氏瓊脂(SDA)等 5種培養(yǎng)基上的典型菌落，進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，鏡檢，進(jìn)行微生物種類鑒定[8-12]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

按照文獻(xiàn)[13]將試驗所得的雞舍空氣中的微生物濃度(CFU/m3)以及設(shè)施表面的微生物含量(CFU/cm2)等數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換(lg)，其他數(shù)據(jù)不轉(zhuǎn)換，采用Excel 2007和SPSS 19.0進(jìn)行方差分析和多重比較，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 19.0對雞舍內(nèi)總菌落數(shù)與舍內(nèi)各環(huán)境指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析。

表1 雞舍內(nèi)微生物菌群及其專用培養(yǎng)基Table 1 Microbial groups in the chicken barn and selected culture medium

2 結(jié)果與分析

2.1 不同日齡肉雞舍內(nèi)空氣中的微生物含量

不同日齡肉雞舍空氣中微生物總量檢測結(jié)果見表2。由表2可知，總體而言，隨著日齡的增加，肉雞舍內(nèi)微生物含量呈現(xiàn)上升趨勢，以17日齡肉雞舍內(nèi)的空氣微生物平均含量最高，顯著高于7日齡肉雞舍(P<0.05)，但與27日齡肉雞舍相比沒有顯著性差異(P>0.05)。15 cm采樣高度上各日齡肉雞舍空氣微生物含量沒有差異(P>0.05)，平養(yǎng)地面(0 cm采樣高度)及160 cm采樣高度舍內(nèi)空氣微生物含量均以17日齡時最高，顯著高于7日齡(P<0.05)。160 cm采樣高度上，27日齡肉雞舍內(nèi)微生物含量比7日齡時顯著升高(P<0.05)。

表2 不同日齡肉雞舍內(nèi)空氣中的微生物含量(lg)Table 2 Microbial contents (lg) in the air in broiler houses at different ages

注:同行數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Note:Values with different superscripts have significant difference (P<0.05).The same below.

不同日齡肉雞舍各采樣點空氣微生物含量見表3。由表3可以看出，不同日齡肉雞舍內(nèi)各采樣高度上采樣點的微生物含量，均為由雞舍進(jìn)風(fēng)口A-A″斷面向出風(fēng)口E-E″斷面方向呈現(xiàn)增加趨勢;各日齡雞舍進(jìn)風(fēng)口A-A″采樣斷面空氣微生物含量均顯著低于雞舍中部C-C″及其后端的各采樣斷面空氣微生物含量(P<0.05)。各日齡肉雞舍不同采樣高度上的微生物含量均以A-A″采樣斷面最小，而在肉雞舍中部排風(fēng)口處空氣中微生物含量大都維持在較高水平，部分采樣點已明顯高于《畜禽場環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 388-1999)[14]中規(guī)定的肉雞舍內(nèi)空氣微生物含量標(biāo)準(zhǔn)值(2.50×104CFU/m3，對數(shù)值為4.40。微生物含量最大值出現(xiàn)在27日齡肉雞舍的中部15 cm的采樣點，對數(shù)值達(dá)到了5.93±1.23，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出標(biāo)準(zhǔn)值。從不同采樣高度來看，呈現(xiàn)出距飼養(yǎng)地面0～15 cm內(nèi)的空氣中微生物較高，160 cm高度的空氣中微生物較低的現(xiàn)象，其原因是近地面處(0 cm)沉積的糞便和飼料等固體污染物是空氣中微生物的主要來源；15 cm處是雞群的呼吸線高度，雞群的呼吸產(chǎn)物和體表污染物都集中在這一高度帶上；而160 cm處即人類的主要呼吸區(qū)域內(nèi)微生物含量則明顯降低。

表3 不同日齡肉雞舍各采樣點空氣中的微生物含量(lg)Table 3 Microbial contents (lg) in the air in broiler houses at different ages

2.2 肉雞舍不同設(shè)施表面的微生物含量

肉雞舍不同設(shè)施表面微生物含量檢測結(jié)果見表4。由表4可知，不同日齡肉雞舍設(shè)施表面微生物總菌落數(shù)對數(shù)值為(2.99±0.37)～(8.37±0.22)，各種表面微生物總菌落數(shù)由多到少依次為墊料>鐵質(zhì)料線>墻面>塑料水線>應(yīng)急窗玻璃。其中，墊料中微生物總菌落數(shù)最多，7日齡、17日齡和27日齡雞舍墊料中微生物總菌落數(shù)對數(shù)值分別為7.12±0.17,8.37±0.22和7.98±0.43，應(yīng)急窗玻璃表面微生物總菌落數(shù)最少，對數(shù)值分別為3.77±0.21,2.99±0.37和3.00±0.52。這是因為墊料表面附著有大量雞糞、羽毛等污染物，因此微生物總菌落數(shù)較多；而雞舍內(nèi)墻體附近雞群活動較少，糞便等固體污染物較少，因此微生物也相對較少；該雞舍玻璃窗主要為通風(fēng)窗口，相對位置較高，接觸糞便等固體污染物的機(jī)會較少，因此表面微生物總菌落數(shù)相對最少；鐵質(zhì)料線表面存在銹跡，顯得凹凸不平，污染物容易附著在上面，也不易清洗，這可能是鐵質(zhì)料線表面微生物總菌落數(shù)較塑料水線多的原因之一。隨著肉雞日齡的增加，肉雞舍墻面、玻璃和塑料水線表面微生物總菌落數(shù)沒有顯著變化(P>0.05)，而7日齡時墊料、鐵質(zhì)料線的微生物菌落數(shù)顯著低于其他兩棟雞舍(P<0.05)，這可能與肉雞日齡小，雞群活動量小、排泄物少等因素有關(guān)。

表4 不同日齡肉雞舍各類設(shè)施表面的微生物總量(lg)Table 4 Microbial contents (lg) on the surface of the facility in broiler houses

2.3 肉雞舍內(nèi)主要致病微生物的分布特征

肉雞舍內(nèi)主要致病微生物種類和數(shù)量見表5。由表5可知，雞場主要致病性微生物如大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌在實驗雞舍中均有檢出，其中，金黃色葡萄球菌只在墊料中檢出，空氣中未檢出。

表5 肉雞舍內(nèi)主要致病微生物的種類和數(shù)量Table 5 Types and quantities of major pathogenic microorganisms in broiler houses

2.4 肉雞舍環(huán)境對舍內(nèi)主要致病微生物總量的影響

試驗期間，肉雞舍內(nèi)空氣中溫度、濕度及粉塵、CO2和NH3檢測結(jié)果見表6。由表6可知，試驗期間，肉雞舍內(nèi)各環(huán)境指標(biāo)都存在不同程度的變化。微生物含量與環(huán)境因素的相關(guān)性分析結(jié)果見表7。由表7可知，雞舍內(nèi)總菌落數(shù)與舍內(nèi)溫度、濕度、粉塵和CO2含量呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，與NH3含量呈顯著相關(guān)(P<0.05)；大腸桿菌數(shù)量與舍內(nèi)溫、濕度呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，與粉塵和NH3含量呈顯著相關(guān)(P<0.05)；沙門氏菌數(shù)量受溫度和有害氣體含量影響極為顯著(P<0.01)；金黃色葡萄球菌數(shù)量受溫、濕度和CO2含量影響極顯著(P<0.01)，受NH3含量影響顯著(P<0.05)；真菌數(shù)量與舍內(nèi)溫、濕度呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，與粉塵、CO2和NH3含量無明顯相關(guān)性。

表6 肉雞舍內(nèi)環(huán)境指標(biāo)檢測結(jié)果Table 6 Environmental parameters in broiler houses

表7 空氣中微生物含量與環(huán)境因素的相關(guān)性分析Table 7 Correlation analysis of microbial concentration and environmental factors in the air

注：*表示相關(guān)系數(shù)在0.05水平上顯著(雙尾檢驗)；**表示相關(guān)系數(shù)在0.01水平上顯著(雙尾檢驗)。

Note:* indicates correlation significant at the 0.05 level (2-tailed).** indicates correlation extrmely significant at the 0.01 level (2-tailed).

3 討 論

空氣環(huán)境及養(yǎng)殖設(shè)施表面的微生物數(shù)量是畜禽舍環(huán)境質(zhì)量狀況的重要評價指標(biāo)之一[2]。世界衛(wèi)生組織指出，當(dāng)空氣中的細(xì)菌濃度達(dá)到700～1 800 CFU/cm3時可以引發(fā)明顯的空氣感染現(xiàn)象，但當(dāng)空氣中的細(xì)菌濃度小于180 CFU/cm3時，則不會有明顯的引發(fā)感染情況。本研究表明，不同日齡的地面平養(yǎng)機(jī)械通風(fēng)肉雞舍內(nèi)微生物含量隨著肉雞日齡的增加而呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，其濃度在(0.50×103)～(2.40×104) CFU/cm3，對數(shù)值為(2.70±0.22)～(4.38±1.32);除7日齡肉雞舍160 cm高度外，其余采樣點均超出了世界衛(wèi)生組織建議空氣細(xì)菌濃度的安全界限范圍，但均未超出《畜禽場環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 388-1999)[14]中規(guī)定的肉雞舍內(nèi)空氣微生物含量標(biāo)準(zhǔn)值(25 000 CFU/m3)。另外，從分布特征上看，肉雞舍內(nèi)微生物平均濃度呈現(xiàn)出低部(肉雞活動區(qū)域從地面到地面上15 cm)遠(yuǎn)大于上部(160 cm)，進(jìn)風(fēng)口端小于雞舍中部與排風(fēng)口端的現(xiàn)象。其原因是這一范圍內(nèi)近地面處堆積的糞便與墊料等固體物以及雞群的呼吸和體表污染物可能是空氣中微生物的主要來源。本研究結(jié)果還表明，肉雞日齡越大，越接近通風(fēng)路徑中后部，空氣中微生物含量越高，如空氣微生物濃度最大值出現(xiàn)在27日齡肉雞舍的中部15 cm的采樣點，達(dá)到了8.51×105CFU/m3(對數(shù)值為5.93±1.23)，超出標(biāo)準(zhǔn)值33.04倍。不同設(shè)施表面微生物數(shù)量差別較大，均不同程度超出了《畜禽場環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。說明在冬季狀態(tài)下，即使機(jī)械通風(fēng)，肉雞舍的空氣環(huán)境也存在著極大的細(xì)菌感染風(fēng)險，但其發(fā)病程度與細(xì)菌致病性的關(guān)系，則有待于進(jìn)一步研究。

在微生物種類方面，本試驗在肉雞舍內(nèi)檢測出了大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，雖然金黃色葡萄球菌只在墊料中檢出，筆者認(rèn)為依然存在感染風(fēng)險。同時墊料中含有大量的大腸桿菌，說明作為一種厭氧型細(xì)菌，大腸桿菌在雞舍空氣環(huán)境下不易存活。本研究結(jié)果表明，冬季肉雞舍內(nèi)空氣細(xì)菌總菌落數(shù)與舍內(nèi)溫度、濕度、粉塵以及CO2含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，說明肉雞舍內(nèi)各環(huán)境因素對空氣中的微生物含量有顯著影響。實際生產(chǎn)中,冬季肉雞舍常常由于保溫需要而致通風(fēng)不良，溫度、濕度增大，促使墊料及空氣中微生物的生長繁殖加速，從而增加了空氣微生物的含量，這與張鶴平[15]“冬季雞舍空氣細(xì)菌含量最高”的研究結(jié)果一致。

有研究表明，雞舍內(nèi)空氣環(huán)境中CO2與NH3濃度嚴(yán)重超標(biāo)，氧氣含量不足，以及各環(huán)境因子與病原微生物間的相互作用，可能是導(dǎo)致雞群發(fā)病的主要原因[16]。雞場發(fā)生的疫病中，多數(shù)為氣源性傳染病，如禽流感、新城疫等。一些有害微生物可能會通過氣體交換不斷向外界排放，致使一些病原微生物隨著廢氣排到舍外，造成大氣環(huán)境微生物污染，給人畜健康帶來威脅[17]。因此，在規(guī)?；怆u養(yǎng)殖中，不僅要保證養(yǎng)殖環(huán)境良好，還要通過雞舍建筑的合理選型設(shè)計、舍內(nèi)溫度控制以及科學(xué)的通風(fēng)設(shè)計[5,18]，控制肉雞舍環(huán)境中的微生物水平，從而在提高肉雞健康水平、經(jīng)濟(jì)效益的同時，減少對周圍環(huán)境的污染。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，冬季地面平養(yǎng)機(jī)械通風(fēng)模式的不同日齡肉雞舍內(nèi)空氣微生物總量為(0.50×103)～(2.40×104) CFU/m3(對數(shù)值為(4.49±0.00)～(5.93±1.23))，以17日齡肉雞舍內(nèi)的空氣微生物含量最大。舍內(nèi)微生物含量以進(jìn)風(fēng)口端最低，向排風(fēng)口端呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，其中有13個采樣點空氣微生物數(shù)量超過了《畜禽場環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 388-1999)的規(guī)定濃度。從不同采樣高度來看，距飼養(yǎng)地面0～15 cm內(nèi)的空氣中微生物含量明顯高于160 cm處的微生物含量。肉雞舍內(nèi)設(shè)施表面單位面積的總微生物含量則在(0.98×103)～(2.34×108) CFU/cm2(對數(shù)值為(2.99±0.34)～(8.37±0.22))，總菌落數(shù)由多到少依次為墊料>鐵質(zhì)料線>墻面>塑料水線>應(yīng)急窗玻璃。在致病菌種類方面，大腸桿菌、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌均有檢出，但金黃色葡萄球菌只存在于墊料中，而大腸桿菌和沙門氏菌則在墊料與空氣中均有。同時，舍內(nèi)的空氣細(xì)菌總菌落數(shù)隨著舍內(nèi)溫度、濕度的升高以及粉塵、NH3和CO2濃度的升高而增加。說明冬季地面平養(yǎng)機(jī)械通風(fēng)肉雞舍內(nèi)微生物含量存在超標(biāo)情況，部分病菌存在于雞舍空氣及墊料中，存在環(huán)境感染風(fēng)險。由此可見，冬季應(yīng)做好保溫與通風(fēng)管理工作，以控制肉雞舍環(huán)境中的微生物水平，降低環(huán)境風(fēng)險。

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