吉仁花，于林清，白淑蘭

(1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010019；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

金達(dá)苜蓿(MedicagosativaL.cv.Jinda)是由來自伊朗、伊拉克、西班牙和高加索地區(qū)的大量育種材料選育而成的一個新品種，其枝條匍匐生長,分枝密集,抗寒能力強(qiáng)，葉片、花和種子均比一般紫花苜蓿小, 是唯一一種草坪型紫花苜蓿，在我國西北、華北、東北、華東地區(qū)均可種植，用于公路護(hù)坡、果園綠化、葡萄園美化以及廣場綠地。

金達(dá)苜蓿染色體加倍育種的主要目的是獲得四倍體的純合體，研究不同倍性苜蓿的遺傳特性，在不同倍性間實現(xiàn)基因的流動。紫花苜蓿是天然同源四倍體，雖然其純合個體不表現(xiàn)出優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，但不同種質(zhì)間的雜交表現(xiàn)出較好的雜交優(yōu)勢, 且其雜種優(yōu)勢隨親本遺傳差異的增大而增加[1]。所以將金達(dá)苜蓿純合個體應(yīng)用于雜交育種, 可以最大限度地提高紫花苜蓿的雜合性, 從而增強(qiáng)其抗性，提高產(chǎn)草量，培育出優(yōu)良品質(zhì)的苜蓿品種。

隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，利用秋水仙素人工誘導(dǎo)多倍體的報道較多[2-6]。采用浸種法，利用秋水仙素誘導(dǎo)直立型扁蓿豆、扁蓿豆新品系90-36、清水苜蓿均獲得了多倍體植株[7-9]。但苜蓿離體狀態(tài)下秋水仙素誘導(dǎo)染色體加倍的研究尚較欠缺[10]。本試驗以金達(dá)苜蓿種子為材料, 利用秋水仙素結(jié)合組織培養(yǎng)，以獲得金達(dá)苜蓿四倍體的純合體，為不同倍性苜蓿的遺傳特性研究及不同倍性間實現(xiàn)基因的流動奠定基礎(chǔ)， 也為苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化研究提供堅實的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

金達(dá)苜蓿種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所育種實驗室提供，經(jīng)鑒定均為二倍體(2n=16)。

1.2 培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)基配方 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：SH(Schenk and Hildebrandt medium)+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA；愈傷組織分化培養(yǎng)基：MSO(MS大量、微量元素、鐵鹽+B5有機(jī))+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂；生根培養(yǎng)基：1/2MS+30 g/L蔗糖+7.5 g/L瓊脂。滅菌前先將各培養(yǎng)基的 pH 值調(diào)至 5.8，121 ℃高壓滅菌 20 min。

1.2.2 培養(yǎng)條件 光周期為16 h/d,光照強(qiáng)度12 500～50 000 μmol/(m2·s)，晝夜溫度24 ℃/18 ℃。

1.3 離體組織染色體加倍試驗方法

1.3.1 種子消毒及無菌苗的培養(yǎng) 選取飽滿的成熟金達(dá)苜蓿種子，用砂紙打磨后置于盛有體積分?jǐn)?shù)70%酒精的三角瓶中消毒45 s,用無菌水沖洗4次，放入2%次氯酸鈉溶液浸泡30 min,不斷搖動三角瓶以充分消毒滅菌，然后置于超凈工作臺內(nèi)，在超凈工作臺倒掉消毒液,用無菌水沖洗5次,最后用滅菌的濾紙吸干種子表面的液體，接種到生根培養(yǎng)基上。

1.3.2 外植體的準(zhǔn)備 采用孔舒穎[8]的方法,將生長6～8 d的無菌苗置于已滅菌的濾紙上，用小刀切取幼嫩的子葉,切成3～4 mm的小方塊。將這些小方塊作為外植體分別接種在含0.02，0.07，0.12 mg/mL秋水仙素溶液的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以接種不添加秋水仙素的相同培養(yǎng)基為對照。每個處理接種6個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿接種10個外植體，3次重復(fù)。

1.3.3 愈傷組織的誘導(dǎo) 將經(jīng)過不同時間(1，3，7 d)培養(yǎng)的外植體接入不添加秋水仙素的同一培養(yǎng)基繼續(xù)誘導(dǎo)，60 d后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，觀察記錄生長狀態(tài)并統(tǒng)計愈傷組織數(shù)，計算愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.3.4 誘導(dǎo)愈傷組織分化 將誘導(dǎo)出的正常愈傷組織接入分化培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，15 d后根據(jù)愈傷組織塊的大小將愈傷組織再切塊進(jìn)行繼代培養(yǎng)，期間根據(jù)愈傷分化情況多次繼代，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計胚狀體的分化率。

1.3.5 生根培養(yǎng) 將誘導(dǎo)分化出芽的愈傷組織分別轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中,15 d換1次培養(yǎng)基,繼續(xù)生根。誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后即可出現(xiàn)根的突起,35 d左右即可長出短根,以后逐漸形成正常根，直到50 d統(tǒng)計其成苗率。

1.3.6 煉苗與移栽 誘導(dǎo)分化出的再生無菌苗根系充分發(fā)達(dá)，在誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)的第55～60天可以煉苗。先在培養(yǎng)箱內(nèi)將三角瓶口打開，2 d后置于光照下培養(yǎng)。在此過程中逐漸通風(fēng)、增加光照，5 d后從三角瓶中取出幼苗，將根系上的培養(yǎng)基沖洗干凈，再移栽到裝有1/3培養(yǎng)基質(zhì)(m(蛭石)∶m(土)為1∶1)的100 mL塑料小杯中，用保鮮膜保濕，以提高再生植株移栽成活率。因移栽后的幼苗生長發(fā)育需要大量營養(yǎng)，僅靠基質(zhì)中的養(yǎng)分不能滿足幼苗生長的需要，因此必須用人工方法在基質(zhì)中添加完全營養(yǎng)液20 mL/杯，補(bǔ)充幼苗生長所需礦質(zhì)營養(yǎng)，以保證再生小植株生長良好。當(dāng)幼苗長到50 cm大小移入大花盆內(nèi)，統(tǒng)計移栽成活率。

1.3.7 再生植株的倍性鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：觀察秋水仙素處理金達(dá)苜蓿幼苗的地徑、葉片形態(tài)和葉色等外部形態(tài)特征,篩選出莖粗、葉片寬且肥厚、葉色濃綠、葉表粗糙的處理幼苗初步鑒定為加倍成功植株。

根尖細(xì)胞染色體觀察：移栽幼苗開始分蘗時，取出整個植株，將根系洗凈。從根系中取出新鮮、光滑、白色透明的長度約1.5 cm的根尖，放入8-羥基喹啉中預(yù)處理3 h,然后用卡諾固定液(V(體積分?jǐn)?shù)95%乙醇)∶V(冰醋酸)=3∶1)固定24 h，1 mol/L HCl解離4 min后，用石炭酸-品紅溶液染色2 h,壓片、鏡檢，觀察染色體，選取分散相好的壓片用Olympus顯微攝影儀照相。每種處理下的加倍再生植株幼苗各取5枚根尖進(jìn)行壓片觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素對金達(dá)苜蓿愈傷組織形態(tài)特征及生長的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，金達(dá)苜蓿外植體誘導(dǎo)的愈傷組織形態(tài)結(jié)構(gòu)受材料本身和秋水仙素的影響。經(jīng)秋水仙素處理后的愈傷組織生長緩慢，易褐化，且呈不規(guī)則膨大，隨著秋水仙素質(zhì)量濃度的升高、處理時間的遞增，愈傷組織生長更緩慢，褐化也加重，該類型的愈傷組織在后期長勢也非常弱。根據(jù)本研究情況，秋水仙素處理的愈傷組織形態(tài)結(jié)構(gòu)大致可以分為4大類型：Ⅰ類型為深綠色，結(jié)構(gòu)堅硬，生長緩慢；Ⅱ類型為亮黃色，內(nèi)外有很多綠色顆粒，結(jié)構(gòu)松軟，黏稠狀，生長較快；Ⅲ類型為乳白色或黃色，糨糊狀，無顆粒結(jié)構(gòu)，生長較慢；Ⅳ類型為褐色，結(jié)構(gòu)致密，生長緩慢(圖1)。

對照的外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織多數(shù)為類型Ⅱ，生長到后期時還出現(xiàn)較少比例的類型Ⅰ和類型Ⅳ。經(jīng)不同質(zhì)量濃度秋水仙素處理不同時間的愈傷組織中少部分為類型Ⅱ，多數(shù)為類型Ⅲ和Ⅰ，而且在愈傷組織分化時類型Ⅳ占有較大比例。4種類型的愈傷組織中Ⅱ類型的愈傷組織先在葉片邊緣切口處形成淺綠色顆粒狀的愈傷組織，之后逐步擴(kuò)展到整個切口及全葉，培養(yǎng)到35 d左右，愈傷組織呈亮黃色，直徑可達(dá)1.3 cm，多數(shù)為生長狀態(tài)良好、健康的愈傷組織，比其他3種類型的愈傷組織較少出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，為繼代增殖和分化培養(yǎng)的最佳愈傷組織。Ⅲ類型的愈傷組織剛形成時為黃綠色，在后期生長較慢，多數(shù)為黏性，含水率高且個別出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，可再增殖和分化的利用率比Ⅱ類型的愈傷組織低。Ⅱ類型及Ⅲ類型的愈傷組織均能在MSO培養(yǎng)基內(nèi)分化出綠色的芽點,但Ⅲ類型的愈傷組織分化時間較長,其愈傷組織在分化培養(yǎng)基MSO中連續(xù)繼代14次仍未分化產(chǎn)生綠色芽點。Ⅰ類型的愈傷組織也可以連續(xù)繼代培養(yǎng)，但隨著繼代次數(shù)的增加愈傷組織呈不規(guī)則膨大，最終無胚狀體和分化苗的產(chǎn)生；Ⅳ類型的愈傷組織生長后期多數(shù)出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，喪失分化能力。

2.2 秋水仙素對金達(dá)苜蓿愈傷組織誘變效果的影響

當(dāng)采用誘變劑處理植物細(xì)胞時,誘變劑的質(zhì)量濃度和處理時間2個因素都會很大程度地影響加倍效果, 因此為獲得較高的誘導(dǎo)率又保持較高的成活率，選擇適當(dāng)?shù)恼T變劑質(zhì)量濃度和處理時間組合十分重要[11]。從表1可以看出，秋水仙素質(zhì)量濃度及處理時間對金達(dá)苜蓿愈傷組織的形成影響較大,隨著秋水仙素質(zhì)量濃度的升高和處理時間的遞增,愈傷組織的形成受抑制程度明顯加大。當(dāng)秋水仙素質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL、處理時間為7 d時僅有39.5%的愈傷組織能保持正常生長；而當(dāng)秋水仙素質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL、處理時間為1 d時，愈傷化程度最高，愈傷組織誘導(dǎo)率為63.5%。多種處理條件下的多數(shù)愈傷組織雖被轉(zhuǎn)入不含秋水仙素的培養(yǎng)基中,但隨著生長時間的延長呈不規(guī)則膨大或者慢慢褐化，最后失去生活力。

本研究參考Saunders等[12]的方法,選擇誘導(dǎo)愈傷組織分化培養(yǎng)基為不添加任何激素的MSO培養(yǎng)基。將誘導(dǎo)出的亮黃色、松軟、較大的愈傷組織轉(zhuǎn)入MSO培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。分化結(jié)果可分為兩大類型：① 秋水仙素各處理組合的少數(shù)愈傷組織在MSO培養(yǎng)基內(nèi)繼續(xù)生長一段時間后分化形成綠色芽點。此類型的分化愈傷組織在生長后期利于生根，為最佳分化愈傷組織。② 秋水仙素各處理組合的絕大多數(shù)愈傷組織在MSO培養(yǎng)基內(nèi)表面呈白色毛狀根，布滿白色粉末狀物或變黃，最終無綠色芽點的分化(圖2)。從表1可以看出,隨著秋水仙素質(zhì)量濃度的升高和處理時間的延長，金達(dá)苜蓿愈傷組織分化率表現(xiàn)為逐步降低的趨勢。秋水仙素質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL、處理時間為7 d時，愈傷組織分化率僅達(dá)到14.71%；秋水仙素質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL、處理時間為1 d時，愈傷組織分化率為最高，達(dá)到39.17%。

A.類型Ⅰ;B.類型Ⅱ;C.類型Ⅲ;D.類型Ⅳ A.TypeⅠ;B.TypeⅡ;C.TypeⅢ;D.TypeⅣ圖1 秋水仙素處理后的金達(dá)苜蓿愈傷組織類型Fig.1 Callus types of Medicago sativa L.cv.Jinda after colchicine treatment

秋水仙素質(zhì)量濃度/(mg·mL-1)Colchicinequalityconcentration處理時間/dTreatmenttime愈傷組織誘導(dǎo)率/%Callusinductionrate愈傷組織分化率/%Callusregenerationfrequency成苗率/%Regenerationrate0.02163.539.1717.50.07162.028.2125.00.12158.028.7119.00.02361.532.2012.90.07360.533.6324.10.12349.523.336.70.02757.528.048.70.07754.518.1737.50.12739.514.7111.1CK79.054.2846.7

A～B.秋水仙素處理后的愈傷組織分化形成綠色芽點；C～D.秋水仙素處理后的愈傷組織表面呈白色毛狀根，布滿白色粉末狀物或變黃，最終無綠色芽點的分化A-B.Callus differentiation after colchicine treatment forms green buds;C-D.Colchicine treatment of callus surface white hairy roots, covered with white powder or yellowing,and ultimately no differentiation of green buds

觀察發(fā)現(xiàn)，由于秋水仙素的影響，最終僅有極少數(shù)帶有綠色芽點的愈傷組織能夠繼續(xù)生長,且生長緩慢。在誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后出現(xiàn)根的突起，35 d左右可長出短根,以后逐漸形成正常根(圖3)。從表1可以看出，經(jīng)秋水仙素處理的愈傷組織，其再生苗的形成受到不同程度的影響，表現(xiàn)為當(dāng)秋水仙素質(zhì)量濃度為0.07 mg/mL、處理時間分別為1，3，7 d時成苗率為25.0%，24.1%，37.5%。

A．在誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后出現(xiàn)根的突起，35 d左右可長出短根；B．在誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基上逐漸形成正常根A.In the induction of rooting medium for 20 days root protrusions appears and for about 35 d short roots grow out;B.In the induction of rooting medium a normal root gradually forms圖3 秋水仙素處理金達(dá)苜蓿愈傷組織分化成苗結(jié)果Fig.3 Effect of colchicine on plant regeneration from Medicago sativa L.cv.Jinda callus

2.3 秋水仙素處理金達(dá)苜蓿變異株的倍性鑒定

無論采用何種方法誘導(dǎo)多倍體產(chǎn)生，并不是所有被處理的組織、器官或細(xì)胞都能成為2倍于原來的染色體，有的細(xì)胞染色體可能未加倍，有的可能重復(fù)加倍，形成的一般是混倍體或嵌合體。所以采用形態(tài)鑒定和細(xì)胞鑒定相結(jié)合的方法進(jìn)行倍性鑒定，以篩選出真正的多倍體植株。

形態(tài)學(xué)鑒定：一般認(rèn)為,植物營養(yǎng)器官性狀的變化與基因劑量有關(guān),即隨著基因拷貝數(shù)的增加,基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量發(fā)生變化,性狀發(fā)生相應(yīng)變化[13]。經(jīng)秋水仙素誘導(dǎo)處理的金達(dá)苜蓿愈傷組織分化總體表現(xiàn)為，植株明顯較對照高大,分枝數(shù)較多,葉片肥厚且變大,葉片表面粗糙,莖間變長,幼根尖端膨大、幼苗生長緩慢、匍匐性變?nèi)?圖4)。根據(jù)這些表型性狀初步鑒定出變異植株。

A.植株：左邊是二倍體植株，右邊是變異植株；B.葉片：左邊是二倍體植株葉片，右邊是變異植株葉片A.Plants:The left is diploid plants,the right is the variation plants;B.Leaves:Leaves on the left side of the diploid plants,the right is the leaves of the variation plants

根尖染色體的觀察：經(jīng)形態(tài)特征鑒定后挑選出的再生植株進(jìn)行細(xì)胞染色體數(shù)目檢測。檢測結(jié)果顯示，經(jīng)過離體組織細(xì)胞染色體加倍方法獲得的變異植株為四倍體與二倍體的混倍體，即根尖細(xì)胞中2n=16、2n=32共存。在對照再生植株移栽幼苗根尖的倍性觀察中均未發(fā)現(xiàn)有四倍體(2n=32)的植株(圖5)。

A．二倍體植株根尖細(xì)胞染色體；B．混倍體植株根尖細(xì)胞染色體A.Chromosomes of root tip cells with diploid plant;B.Chromosomes of root tip cells with mixoploid plant

3 討 論

3.1 加倍植株染色體的混倍性

經(jīng)秋水仙素處理的愈傷組織單細(xì)胞分化芽點再生長成幼苗,理論上所誘導(dǎo)形成的再生植株為四倍體的純合體，從而可避免混倍體的出現(xiàn)[14]。本研究通過秋水仙素處理獲得金達(dá)苜蓿加倍植株為二倍體與四倍體的混倍體。前人用秋水仙素處理鴨茅、杉木、朝鮮百合和唇形科青蘭屬植物Dracocephalumkotschyi種子或愈傷組織，獲得的也均為二倍體和四倍體的混倍體植株[15-18]，說明在秋水仙素誘導(dǎo)多倍體加倍過程中只是部分細(xì)胞得到了加倍。這可能是由于本研究以金達(dá)苜蓿葉片為載體，秋水仙素處理愈傷組織的同時不可避免地對葉片也進(jìn)行了處理，所獲得的再生幼苗有可能是從金達(dá)苜蓿葉片直接發(fā)育出來的，即誘導(dǎo)獲得的多倍體再生植株是混倍體。另外，秋水仙素混培法獲得的少量幼苗生長緩慢，隨著再生幼苗的生長發(fā)育，混倍體中多倍體細(xì)胞所占比例越來越小，甚至在生長后期一部分含較多多倍體細(xì)胞的混倍體恢復(fù)成了二倍體[11]，這可能是造成加倍結(jié)果不易獲得純合體，而大量得到混倍體的主要原因。在植株多倍體育種實踐中，還需要在混倍體植株間授粉，經(jīng)過幾代選擇、鑒定，才能獲得真正純合的四倍體株系[19-21]。

3.2 誘導(dǎo)幼苗的移栽成活率

經(jīng)秋水仙素處理獲得的幼苗往往移栽成活率很低，可能是以下3方面因素造成的：首先，大部分再生植株由于根部畸形無法從土壤吸收生長所需的營養(yǎng)，從而停滯生長未能成苗而導(dǎo)致最終死亡[22]。其次，秋水仙素是一種有毒物質(zhì)，再生植株受其毒害作用，不能正常生長發(fā)育。最后，本研究采用的是離體組織染色體加倍技術(shù)，處理后的材料進(jìn)行煉苗、移植，在此過程中誘導(dǎo)幼苗不適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境、移栽操作不恰當(dāng)?shù)拳h(huán)境和人為因素的影響，損失一部分。提高誘導(dǎo)幼苗的移栽成活率可考慮用更高效、更安全、毒性較低的除草劑取代秋水仙素。

3.3 秋水仙素質(zhì)量濃度與處理時間對愈傷組織誘變的影響

不同材料對秋水仙素的耐受力、敏感度不同。對同一種材料而言，隨秋水仙素質(zhì)量濃度的增大染色體加倍率也會提高[23]。但秋水仙素對細(xì)胞的毒害作用也加大，因此秋水仙素質(zhì)量濃度和效果之間并不成正比[24]。本研究中，不同處理組合對金達(dá)苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)效果差異明顯，隨著秋水仙素質(zhì)量濃度和處理時間的遞增，秋水仙素對愈傷組織的毒害作用加大，愈傷組織產(chǎn)生遲、生長慢，表現(xiàn)明顯的生長抑制現(xiàn)象，從而誘導(dǎo)出形態(tài)結(jié)構(gòu)不同類型的愈傷組織，而且愈傷組織的生長狀態(tài)直接影響其分化出芽。原因可能是，結(jié)構(gòu)致密、硬團(tuán)狀的愈傷組織，通氣、透水、透光性較差，其生長以及分化受到抑制；而內(nèi)外有很多綠色顆粒、結(jié)構(gòu)松軟、黏稠狀的愈傷組織，通光、透水及透氣性較強(qiáng)，有利于分化形成多個芽點，誘導(dǎo)形成叢生芽的幾率較大。Mori等[25]對二倍體小星辰花(Limoniumbellidifolium)加倍，用0.05%秋水仙素處理72 h時，最高頻率的四倍體和混倍體發(fā)生。

秋水仙素質(zhì)量濃度及處理時間是直接影響處理效果的2個因素[9]。用秋水仙素水溶液處理外植體時，有關(guān)質(zhì)量濃度和處理時間的組合問題研究結(jié)論不一。李潔等[26]研究結(jié)果顯示，用0.1%秋水仙素和1%助滲劑DMSO誘導(dǎo)直立型扁蓿豆染色體加倍效果較好。張穎[27]研究結(jié)果顯示，0.03%秋水仙素處理72 h誘導(dǎo)羊草與灰色賴草雜種 F1染色體加倍效果較好。本研究結(jié)果顯示，采用0.07 mg/mL的秋水仙素處理3 d染色體加倍效果較好。本研究結(jié)果與上述2種結(jié)果不同的原因可能是，利用秋水仙素誘導(dǎo)金達(dá)苜蓿染色體加倍與秋水仙素質(zhì)量濃度和處理時間不呈正比關(guān)系；秋水仙素質(zhì)量濃度過低，處理時間越短，不能產(chǎn)生染色體加倍效應(yīng)；濃度過高，處理時間越長，則對外植體有毒害作用，從而抑制植物材料的生長甚至死亡。另外，經(jīng)秋水仙素處理后的金達(dá)苜蓿愈傷組織，難免受到誘變方法、基因型以及處理溫度等因素的影響，其中任何一項因素的改變，都可能會影響染色體加倍效果。

4 結(jié) 論

利用秋水仙素染色體加倍研究表明，隨著秋水仙素質(zhì)量濃度的升高、處理時間的延長毒害作用隨之增強(qiáng)，0.07 mg/mL秋水仙素處理3 d是獲得多倍體變異苗的最佳條件，愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到60.5%，愈傷組織分化率為33.63%，誘變幼苗成苗率為24.1%，并且誘導(dǎo)產(chǎn)生混倍體植株，要獲得純合的金達(dá)苜蓿四倍體植株，還需進(jìn)一步深入研究。

志謝：本研究得到了白淑蘭教授、于林清研究員的指導(dǎo)，在此表示感謝。

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