魏尊苗，劉佳遙，程 艷，王占海，許方達(dá)，陳 欣，牟忠生

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)植物研究所，吉林 長(zhǎng)春 130033）

油莎豆是集油、糧、牧、飼于一體的新興經(jīng)濟(jì)作物，富含脂肪、淀粉、糖、維生素和礦物質(zhì)。其中，脂肪含量約為30%，非洲有些油莎豆品種脂肪含量在40%以上[1]。大力發(fā)展油莎豆產(chǎn)業(yè)，可增加油脂、淀粉和飼料供應(yīng)，緩解能源短缺，對(duì)保障我國(guó)食用植物油、糧食和動(dòng)物蛋白質(zhì)供給安全等有重要的現(xiàn)實(shí)意義和戰(zhàn)略意義。油莎豆開(kāi)花一般不結(jié)實(shí)[2]，即使結(jié)實(shí)成熟度也不好[3]，主要以塊莖繁殖。目前，油莎豆育種主要通過(guò)系選和誘變的方法，誘變育種可以提高突變頻率、創(chuàng)造新基因，縮短育種年限，被廣泛應(yīng)用。何嘉欣等[4]開(kāi)展了EMS溶液對(duì)油莎豆塊莖萌發(fā)特性的影響研究，確定了油莎豆EMS 誘變的最適條件。秋水仙素是使用范圍廣且處理效果較好的誘變劑[5]，在大棗[6]、蘋(píng)果[7]、黃瓜[8]、西瓜[9]、萬(wàn)壽菊[10]等作物上均有應(yīng)用，但在油莎豆塊莖上的報(bào)道很少。吳瓊[11]采用秋水仙素誘變油莎豆離體莖尖，獲得了染色體加倍的植株。李佳婷[12]用秋水仙素處理油莎豆無(wú)菌苗，獲得了四倍體油莎豆植株。但尚未見(jiàn)秋水仙素誘變油莎豆塊莖和誘變后塊莖品質(zhì)分析的報(bào)道。為此，利用不同質(zhì)量濃度的秋水仙素溶液分別誘變萌發(fā)前和萌發(fā)后油莎豆塊莖，以期確定油莎豆塊莖秋水仙素誘變半致死劑量，并對(duì)誘變株塊莖的品質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，分析秋水仙素誘變對(duì)油莎豆塊莖品質(zhì)的影響，從誘變材料中篩選出高品質(zhì)變異株，為油莎豆品質(zhì)育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況及試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021 年6—10 月在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)植物研究所試驗(yàn)地進(jìn)行，土質(zhì)為砂壤土。

供試油莎豆為吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)植物研究所油莎豆團(tuán)隊(duì)自育品系SS4-3（長(zhǎng)粒型），發(fā)芽率在95%以上。化學(xué)誘變劑為秋水仙素，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 秋水仙素溶液的制備 采用8.5 g/L NaCl 溶液溶解秋水仙素，分別稱(chēng)取秋水仙素粉末，配制質(zhì)量濃度為0（CK）、1、2、3、4 g/L的秋水仙素溶液。

1.2.2 秋水仙素誘變萌發(fā)前油莎豆塊莖 選擇飽滿(mǎn)無(wú)蟲(chóng)眼油莎豆塊莖900 粒，用0.3%多菌靈浸泡15 min，然后于35 ℃恒溫箱中清水浸泡12 h，充分吸水后取出，用濾紙將其表面水分吸干，室溫下，分別用上述5 個(gè)不同質(zhì)量濃度的秋水仙素溶液浸泡，設(shè)3 個(gè)誘變時(shí)間，分別為12、24、36 h，共15 個(gè)處理，每個(gè)處理3 次重復(fù)，每次重復(fù)20 粒。浸泡處理結(jié)束，用流水沖洗5 遍，放置發(fā)芽盤(pán)中35 ℃催芽，統(tǒng)一進(jìn)行播種，株距10 cm，行距65 cm，施用復(fù)合肥1 000 kg/hm2，進(jìn)行常規(guī)田間管理。1 個(gè)月后統(tǒng)計(jì)出苗數(shù)，計(jì)算出苗率。

1.2.3 秋水仙素誘變萌發(fā)后油莎豆塊莖 選擇飽滿(mǎn)無(wú)蟲(chóng)眼油莎豆塊莖1 000 粒，用0.3%多菌靈浸泡15 min，然后于35 ℃恒溫箱中清水浸泡12 h，充分吸水后取出，放到發(fā)芽盤(pán)中35 ℃催芽，每天清洗一遍，萌發(fā)后挑選發(fā)芽一致的900粒，用濾紙吸干表面水分后立即進(jìn)行誘變處理，誘變劑質(zhì)量濃度、誘變時(shí)間及田間管理等均與1.2.2相同。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

油莎豆塊莖成熟后人工單株收獲，清洗表面，自然晾曬，含水量降到約13%后采用近紅外谷物分析儀（波通7250A）對(duì)誘變塊莖進(jìn)行品質(zhì)檢測(cè)，包括脂肪含量、蛋白質(zhì)含量、總糖含量、淀粉含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22 軟件進(jìn)行處理、統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素誘變萌發(fā)前油莎豆塊莖對(duì)出苗率的影響

使用秋水仙素對(duì)萌發(fā)前油莎豆塊莖進(jìn)行誘變（表1），發(fā)現(xiàn)油莎豆出苗率總體上隨著秋水仙素質(zhì)量濃度和誘變時(shí)間的增加而逐漸降低。正常條件下，油莎豆出苗率最高可達(dá)到96.66%；在秋水仙素質(zhì)量濃度4 g/L、誘變時(shí)間36 h條件下，出苗率最低，為20.00%；在秋水仙素質(zhì)量濃度1 g/L、誘變時(shí)間24 h條件下，出苗率為51.67%，接近半致死劑量。

表1 秋水仙素誘變萌發(fā)前油莎豆塊莖對(duì)出苗率的影響Tab.1 Effect of colchicine mutagenesis before tuber germination on emergence rate of tigernut

方差分析結(jié)果（表2）顯示，使用秋水仙素對(duì)萌發(fā)前油莎豆塊莖進(jìn)行誘變，秋水仙素質(zhì)量濃度對(duì)油莎豆出苗率的影響達(dá)到極顯著水平，誘變時(shí)間對(duì)出苗率的影響達(dá)到顯著水平。

表2 秋水仙素誘變萌發(fā)前油莎豆塊莖對(duì)出苗率影響的方差分析Tab.2 Variance analysis of effect of colchicine mutagenesis on emergence rate of tigernut before germination

2.2 秋水仙素誘變萌發(fā)后油莎豆塊莖對(duì)出苗率的影響

使用秋水仙素對(duì)萌發(fā)后油莎豆塊莖進(jìn)行誘變（表3），發(fā)現(xiàn)油莎豆出苗率隨著秋水仙素質(zhì)量濃度和誘變時(shí)間的增加而逐漸降低。正常條件下，油莎豆出苗率最高可達(dá)到98.33%；在秋水仙素質(zhì)量濃度4 g/L、誘變時(shí)間36 h 條件下，出苗率最低，為36.67%；在秋水仙素質(zhì)量濃度3 g/L、誘變時(shí)間36 h條件下，出苗率為48.33%，接近半致死劑量。與萌發(fā)前油莎豆塊莖秋水仙素誘變處理相比，萌發(fā)后油莎豆塊莖秋水仙素誘變處理達(dá)到半致死劑量的秋水仙素質(zhì)量濃度更高、誘變時(shí)間更長(zhǎng)，說(shuō)明萌發(fā)后油莎豆塊莖比萌發(fā)前油莎豆塊莖抗誘變能力更強(qiáng)，對(duì)秋水仙素的敏感度更低。

表3 秋水仙素誘變萌發(fā)后油莎豆塊莖對(duì)出苗率的影響Tab.3 Effect of colchicine mutagenesis after tuber germination on emergence rate of tigernut

方差分析結(jié)果（表4）顯示，使用秋水仙素對(duì)萌發(fā)后油莎豆塊莖進(jìn)行誘變，秋水仙素質(zhì)量濃度對(duì)油莎豆出苗率的影響達(dá)到極顯著水平，誘變時(shí)間對(duì)出苗率的影響達(dá)到顯著水平，與萌發(fā)前誘變結(jié)果一致。

表4 秋水仙素誘變萌發(fā)后油莎豆塊莖對(duì)出苗率影響的方差分析Tab.4 Variance analysis of effect of colchicine mutagenesis after tuber germination on emergence rate of tigernut

2.3 秋水仙素誘變對(duì)油莎豆塊莖芽形態(tài)的影響

萌發(fā)前油莎豆塊莖經(jīng)秋水仙素誘變處理后放置發(fā)芽盤(pán)中35 ℃催芽，3 d 后開(kāi)始陸續(xù)發(fā)芽，經(jīng)觀(guān)察，部分芽存在明顯變異，共有3 種變異類(lèi)型，分別為圓形、錐形、半圓半尖（圖1），萌發(fā)后油莎豆塊莖經(jīng)秋水仙素誘變后芽無(wú)明顯變化。

圖1 萌發(fā)前油莎豆塊莖經(jīng)秋水仙素誘變后芽形態(tài)的變化Fig.1 Changes in tigernut bud morphology caused by colchicine mutagenesis on tigernut tuber before germination

2.4 秋水仙素誘變油莎豆塊莖品質(zhì)分析

2.4.1 秋水仙素誘變油莎豆塊莖品質(zhì)變化 經(jīng)秋水仙素誘變的油莎豆塊莖成熟時(shí)，每個(gè)誘變處理選取3 個(gè)誘變株，收獲塊莖并曬干后，進(jìn)行品質(zhì)檢測(cè)（表5）。由表5 可知，油莎豆塊莖萌發(fā)前誘變處理品質(zhì)指標(biāo)的變異系數(shù)為13.97%～22.24%，平均正向變異率為59.72%；油莎豆塊莖萌發(fā)后誘變處理品質(zhì)指標(biāo)的變異系數(shù)為11.69%～18.78%，平均正向變異率為56.95%。總體上萌發(fā)前油莎豆塊莖秋水仙素誘變處理塊莖品質(zhì)指標(biāo)的變異系數(shù)和正向變異率均略高于萌發(fā)后誘變處理。正向變異率最高的是油莎豆塊莖萌發(fā)后誘變處理蛋白質(zhì)含量，為94.44%；正向變異率最低的是油莎豆塊莖萌發(fā)后誘變處理總糖含量，為5.56%。對(duì)油莎豆塊莖萌發(fā)前和萌發(fā)后誘變處理的4個(gè)品質(zhì)指標(biāo)正向變異率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)油莎豆塊莖萌發(fā)前誘變處理和萌發(fā)后誘變處理的脂肪含量正向變異率相同，油莎豆塊莖萌發(fā)后誘變處理蛋白質(zhì)含量和淀粉含量正向變異率高于萌發(fā)前誘變處理，萌發(fā)前誘變處理總糖含量正向變異率遠(yuǎn)高于萌發(fā)后誘變處理。

表5 秋水仙素誘變油莎豆塊莖品質(zhì)變異分析Tab.5 Analysis of tigernut tuber quality mutation induced by colchicine

2.4.2 油莎豆高品質(zhì)變異材料的篩選 根據(jù)育種目標(biāo)，在油莎豆誘變株中篩選出7 個(gè)高品質(zhì)變異材料（表6）。其中，5 個(gè)為油莎豆塊莖萌發(fā)前誘變獲得，2 個(gè)為油莎豆塊莖萌發(fā)后誘變獲得。在高品質(zhì)變異材料中，淀粉含量大于32%的有1個(gè)，為油莎豆塊莖萌發(fā)后誘變所得；總糖含量大于36%的有6個(gè)，其中，萌發(fā)前誘變獲得5 個(gè)，萌發(fā)后誘變獲得1 個(gè)。未獲得脂肪含量大于27%的誘變材料。

表6 7個(gè)油莎豆高品質(zhì)誘變材料近紅外品質(zhì)檢測(cè)Tab.6 Near infrared quality test data of 7 high-quality mutagenic materials

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，油莎豆出苗率隨秋水仙素質(zhì)量濃度和誘變時(shí)間的增加而降低，誘變時(shí)間對(duì)出苗率有顯著影響，秋水仙素質(zhì)量濃度對(duì)出苗率有極顯著影響，秋水仙素質(zhì)量濃度對(duì)出苗率的影響大于誘變時(shí)間，這與任雪羽[13]用秋水仙素誘變木槿種子，任威威[14]用秋水仙素誘變花生種子得出的結(jié)論相同。油莎豆塊莖萌發(fā)前進(jìn)行誘變，秋水仙素質(zhì)量濃度1 g/L、誘變時(shí)間24 h 為其半致死誘變劑量；油莎豆塊莖萌發(fā)后進(jìn)行誘變，秋水仙素質(zhì)量濃度3 g/L、誘變時(shí)間36 h 為其半致死誘變劑量，以誘變質(zhì)量濃度低且誘變時(shí)間短達(dá)到半致死劑量為原則，秋水仙素質(zhì)量濃度1 g/L、誘變萌發(fā)前油莎豆塊莖24 h為其最適秋水仙素誘變半致死劑量，萌發(fā)前油莎豆塊莖對(duì)秋水仙素更敏感。祝朋芳等[15]采用秋水仙素誘變菊花干種子、萌動(dòng)種子、雙子葉期植株，半致死劑量分別為2 g/L 處理1 d、2 g/L 處理0.5 d、20 g/L 處理6 d，同樣得出秋水仙素誘變萌動(dòng)的種子比干種子和雙子葉期植株需要的質(zhì)量濃度低且時(shí)間短。植物誘變一般選擇種子、芽、莖尖、花粉、愈傷組織等生命力較強(qiáng)、分裂旺盛的部位或組織，油莎豆主要以塊莖繁殖，所以本研究以油莎豆塊莖作為誘變材料，分別選取了萌發(fā)前塊莖和萌發(fā)后塊莖進(jìn)行誘變，發(fā)現(xiàn)萌發(fā)前塊莖經(jīng)秋水仙素誘變后部分芽表現(xiàn)出畸形，萌發(fā)后塊莖經(jīng)秋水仙素誘變后芽無(wú)明顯變化，可見(jiàn)萌發(fā)前塊莖對(duì)誘變劑更敏感，萌發(fā)前塊莖秋水仙素誘變半致死劑量在相同時(shí)間下比萌發(fā)后誘變低，說(shuō)明萌發(fā)前油莎豆塊莖是較合適的化學(xué)誘變材料。

品質(zhì)育種的目標(biāo)是改良和提高農(nóng)作物產(chǎn)品品質(zhì)，秋水仙素誘導(dǎo)植物加倍可提高品質(zhì)。彭丹[16]采用秋水仙素誘導(dǎo)的四倍體不結(jié)球白菜烤青和夏帝與二倍體相比，可溶性糖、維生素C含量和干質(zhì)量顯著提高。本研究雖未對(duì)誘變株做倍性鑒定，但是通過(guò)近紅外谷物分析儀對(duì)誘變株塊莖品質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，獲得了6 個(gè)總糖含量增加的高糖變異株和1 個(gè)淀粉含量增加的高淀粉變異株，同樣證實(shí)了秋水仙素誘變可使油莎豆品質(zhì)提高，是油莎豆品質(zhì)育種的有效方法之一。本研究未篩選出高油變異材料，可能與所選基礎(chǔ)材料脂肪含量低有關(guān)，吉莎系SS4-3 脂肪含量較低，僅為14.26%，雖然變異空間較大，正向變異率也較高，達(dá)到66.67%，但是基數(shù)小，最后達(dá)到的峰值有限。所以若要獲得某個(gè)品質(zhì)指標(biāo)高的誘變材料，首先應(yīng)選擇此品質(zhì)指標(biāo)相對(duì)較高的基礎(chǔ)材料，此結(jié)論只是初步推斷，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

秋水仙素誘導(dǎo)多倍體鑒定的方法，主要有形態(tài)學(xué)觀(guān)測(cè)、染色體計(jì)數(shù)、氣孔觀(guān)測(cè)、流式細(xì)胞儀測(cè)定[13]、葉綠素含量測(cè)定[14]等，多種鑒定方法之間相互驗(yàn)證，得出的結(jié)果更準(zhǔn)確，也可以根據(jù)多倍體抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)[17]，嘗試采用脅迫法鑒定油莎豆誘變植株倍性。郭啟高等[18]通過(guò)低溫脅迫法（5 ℃5 h）和高溫脅迫法（50 ℃10 h）檢測(cè)出西瓜四倍體平均符合程度在80%以上，證實(shí)脅迫法可用。油莎豆屬新興植物，學(xué)者對(duì)其染色體研究較少，且油莎豆為無(wú)性繁殖，遺傳背景不詳，此前國(guó)外學(xué)者報(bào)道油莎豆染色體有18 條、108 條和208 條[19]。目前為止，油莎豆染色體數(shù)量及倍性還無(wú)定論，現(xiàn)階段對(duì)油莎豆誘變株進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)鑒定有一定難度，下一步將對(duì)秋水仙素誘變的油莎豆植株進(jìn)行染色體倍性鑒定等深入研究。