梁海峰，劉順枝，黃雯臻，馬澤華，曾惠美，胡位榮

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

火龍果屬仙人掌科（Cactaceae）多年生攀援性肉質(zhì)莖植物，原產(chǎn)中美洲，耐高溫、抗性強(qiáng)?；瘕埞麪I(yíng)養(yǎng)豐富，兼具水果、蔬菜、花卉、保健功能，在墨西哥、美國(guó)、越南等國(guó)家都有商業(yè)化栽培。近年來(lái)，火龍果在我國(guó)臺(tái)灣、福建、海南、廣西和廣東等省區(qū)發(fā)展迅速，已成為一種重要的熱帶和亞熱帶特色水果［1-2］。經(jīng)過(guò)引進(jìn)國(guó)外品種、試種比較和不斷改良選育，獲得了適宜不同生境種植的品種（品系）以及紅皮粉肉、紅皮紫紅肉等新品種［3-6］。我國(guó)火龍果種質(zhì)資源的研究起步較晚，目前主要集中在種質(zhì)的收集、保存和評(píng)價(jià)［7-8］，但是火龍果種質(zhì)仍較匱乏，自主選育的優(yōu)質(zhì)品種尤其少。紅肉火龍果（Hylocereus polyrhizus）為二倍體植物，果實(shí)糖酸比高、口感好，富含甜菜紅素，售價(jià)頗高［9］。針對(duì)紅肉火龍果栽培品種比較單一，自花授粉座果率低，缺乏不同風(fēng)味、耐寒、抗病、耐貯的品種以及砧木，迫切需要開(kāi)展相關(guān)研究［2，10］。

誘變育種是園藝植物非常有效的一種育種方法，大量研究表明，與二倍體植物相比，四倍體具有更強(qiáng)的抗性，有望成為優(yōu)良的抗逆種質(zhì)資源［11-12］。其中，秋水仙素是廣泛運(yùn)用于多倍體育種的一種化學(xué)誘變劑［13-14］，有研究表明，0.1%秋水仙素處理黑果枸杞種子36 h，四倍體誘導(dǎo)率達(dá) 25%［15］。Tel-Zur等［16］利用秋水仙素處理盆栽火龍果植株獲得了同源多倍體，鄧仁菊等［17］報(bào)道了秋水仙素浸漬火龍果幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)誘導(dǎo)多倍體的試驗(yàn)。本文研究秋水仙素不同濃度、處理時(shí)間對(duì)紅肉火龍果種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)的影響，以期為火龍果人工多倍體誘變育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為采自廣州市番禺區(qū)商品性生產(chǎn)果園成熟的紅皮紅肉火龍果紅仙蜜果實(shí)，獲取飽滿種子，自來(lái)水清洗后備用；秋水仙素為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2015年9月在廣州大學(xué)生化實(shí)驗(yàn)樓進(jìn)行。種子經(jīng)0.1%高錳酸鉀溶液浸泡30 min、蒸餾水洗3～5次，自然晾干。將種子隨機(jī)分成兩組，一組種子分別用濃度為0.05%、0.1%、0.2%和0.3%（W/V）的秋水仙素溶液黑暗條件下浸泡24、48、72和96 h（浸種處理）；另一組種子置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中蒸餾水浸泡12 h，待大部分種子吸水脹破種皮露芽，挑選露白種子分別用濃度為0.01%、0.05%、0.1%和0.2%（W/V）的秋水仙素溶液黑暗條件下浸泡12、24和48 h（露白處理）。以蒸餾水浸種處理為對(duì)照（CK）。達(dá)到浸種時(shí)間后取出種子，蒸餾水沖洗3～5次，置于鋪有單層濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿50粒種子，3次重復(fù)，置于28℃光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12 h噴灑等體積蒸餾水，保證種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)所需水分。培養(yǎng)后第9 d統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率、幼苗存活率、苗長(zhǎng)（子葉和胚軸長(zhǎng)）和形態(tài)變異株數(shù)。

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素浸種處理對(duì)紅肉火龍果種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響

2.1.1 秋水仙素濃度和浸種時(shí)間對(duì)種子發(fā)芽率的影響 從表1可以看出，不同濃度秋水仙素、不同浸種時(shí)間對(duì)紅肉火龍果種子發(fā)芽率影響不同。與對(duì)照相比，4個(gè)濃度的秋水仙素處理均降低了紅肉火龍果種子的發(fā)芽率，其中0.3%秋水仙素處理的種子發(fā)芽率平均為84.3%。

同一濃度秋水仙素處理，隨著浸種時(shí)間的延長(zhǎng)，紅肉火龍果種子發(fā)芽率呈下降趨勢(shì)（表1）。0.05%、0.1%秋水仙素浸種24～96 h以及0.2%、0.3%秋水仙素浸種24～48 h，火龍果種子的發(fā)芽率雖然下降，但與對(duì)照及彼此之間差異均不顯著，其中0.1%秋水仙素處理隨著浸種時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)芽率逐漸降低，浸種96 h發(fā)芽率較24 h處理降低了10.4%。進(jìn)一步，當(dāng)濃度為0.2%、0.3%秋水仙素浸種時(shí)間分別延長(zhǎng)至72、96 h，種子發(fā)芽率均比對(duì)照降低19.7%以上，差異顯著。可見(jiàn)，高濃度秋水仙素、長(zhǎng)時(shí)間浸種對(duì)紅肉火龍果種子萌發(fā)起到抑制作用。

2.1.2 秋水仙素濃度和浸種時(shí)間對(duì)幼苗存活率的影響 紅肉火龍果幼苗存活率因秋水仙素濃度和浸種時(shí)間不同而異（表1）。與對(duì)照相比，4個(gè)濃度的秋水仙素處理均降低了火龍果幼苗的存活率，其中0.3%秋水仙素處理的幼苗存活率平均僅58.2%。

表1 秋水仙素浸種處理對(duì)紅肉火龍果種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響

由表1可知，同一濃度秋水仙素處理時(shí)，隨著浸種時(shí)間的延長(zhǎng)，紅肉火龍果幼苗存活率呈降低趨勢(shì)。其中，0.05%秋水仙素浸種24～96 h、0.1%秋水仙素浸種24～72 h、0.2%秋水仙素浸種24～36 h、0.3%秋水仙素浸種24 h，幼苗存活率降低，但彼此之間及與對(duì)照之間差異未達(dá)顯著水平。但是，0.1%秋水仙素浸種96 h、0.2%秋水仙素浸種72 h以及0.3%秋水仙素浸種72、96 h，幼苗存活率分別比對(duì)照下降57.1%、54.2%、57.9%和50.7%，差異顯著?？梢?jiàn)，低濃度秋水仙素較長(zhǎng)時(shí)間浸種、高濃度秋水仙素浸種對(duì)火龍果幼苗造成了嚴(yán)重?fù)p傷甚至導(dǎo)致死亡。

2.1.3 秋水仙素濃度和浸種時(shí)間對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響 由表1可知，秋水仙素浸種處理不同程度抑制了紅肉火龍果實(shí)生幼苗的生長(zhǎng)，其中0.3%秋水仙素處理的幼苗平均長(zhǎng)度僅為對(duì)照的54.8%。同一濃度秋水仙素處理時(shí)，火龍果幼苗長(zhǎng)度隨著浸種時(shí)間延長(zhǎng)而減少。0.05%～0.3%秋水仙素浸種24 h，幼苗長(zhǎng)度與對(duì)照差異不顯著；但當(dāng)浸種時(shí)間延長(zhǎng)至72～96 h，幼苗胚軸生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，苗長(zhǎng)顯著降低，其中0.3%秋水仙素浸種96 h時(shí)苗長(zhǎng)僅為對(duì)照的30.3%。

2.2 秋水仙素露白處理對(duì)紅肉火龍果幼苗生長(zhǎng)的影響

2.2.1 秋水仙素露白處理對(duì)幼苗存活率的影響 從表2可以看出，與對(duì)照相比，4個(gè)濃度的秋水仙素處理露白種子降低了紅肉火龍果幼苗存活率，其中0.2%秋水仙素處理的幼苗平均存活率為74.9%。0.01%～0.2%秋水仙素處理露白種子12、24 h，幼苗存活率與對(duì)照無(wú)顯著差異；但當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)至48 h，幼苗存活率分別下降59.6%、40.8%、41.6%和54.3%，與對(duì)照相比差異顯著。表明秋水仙素短時(shí)間處理露白種子對(duì)胚芽、胚根的正常生長(zhǎng)沒(méi)有明顯損傷作用，但長(zhǎng)時(shí)間處理則產(chǎn)生了毒害、致死作用。

2.2.2 秋水仙素露白處理對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響 不同濃度的秋水仙素露白處理不同程度地抑制了火龍果實(shí)生幼苗的生長(zhǎng)，其中0.2%秋水仙素處理的平均幼苗長(zhǎng)度僅為對(duì)照的29.7%（表2）。

同一秋水仙素濃度下，幼苗長(zhǎng)度隨著處理時(shí)間增加而呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。除0.01%秋水仙素處理露白種子12 h外，其他處理的苗長(zhǎng)與對(duì)照的差異均表現(xiàn)為顯著（表2）。0.01%秋水仙素處理露白種子24 h、0.2%秋水仙素浸種12 h，苗長(zhǎng)分別比對(duì)照減少38.4%和65.8%；0.2%秋水仙素溶液處理24 h，苗長(zhǎng)僅為對(duì)照的26.7%?？梢?jiàn)，隨著秋水仙素濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，秋水仙素對(duì)火龍果露白種子的胚軸、胚根生長(zhǎng)抑制作用越大。

表2 秋水仙素露白處理對(duì)紅肉火龍果幼苗生長(zhǎng)的影響

2.3 秋水仙素處理對(duì)紅肉火龍果幼苗形態(tài)變異的影響

從圖1～圖3（封二）可以看出，與對(duì)照相比，秋水仙素?zé)o論是浸種處理還是露白處理，火龍果幼苗均出現(xiàn)一些形態(tài)上的變異，表現(xiàn)為幼苗矮化、生長(zhǎng)緩慢、子葉肥厚、胚軸膨大。

由表1、表2可知，不同濃度秋水仙素浸種處理、露白處理不同時(shí)間，火龍果幼苗出現(xiàn)不同程度的形態(tài)變異。隨著0.05%、0.1%秋水仙素浸種時(shí)間的延長(zhǎng)，植株形態(tài)變異率呈先升高后下降趨勢(shì)；0.2%、0.3%秋水仙素浸種后的植株形態(tài)變異率則隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而不斷降低（表1）。秋水仙素處理露白種子時(shí)，0.01%秋水仙素處理48 h后植株形態(tài)變異率僅0.2%，而0.2%秋水仙素處理12 h變異率達(dá)到15.8%（表2），但0.1%、0.2%秋水仙素浸種48 h時(shí)沒(méi)有獲得變異植株，可能是因?yàn)楦邼舛惹锼伤亻L(zhǎng)時(shí)間處理時(shí)，秋水仙素更易滲入吸水漲破種皮的露白種子，對(duì)胚芽、胚根毒害作用大，使得存活的幼苗難于恢復(fù)細(xì)胞分裂能力而死亡。

3 結(jié)論與討論

秋水仙素通過(guò)作用于生長(zhǎng)旺盛、分裂活躍部位處于有絲分裂中期的細(xì)胞使染色體加倍，在誘導(dǎo)植物同源多倍體種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育上發(fā)揮了重要作用［11，18］，但不同植物種類、處理部位、處理方法等因素影響誘導(dǎo)效果［13］。火龍果果肉內(nèi)鑲嵌有約5 000粒芝麻狀的黑色種子，可為化學(xué)誘變育種提供充足的材料。與多數(shù)研究結(jié)果［19-22］相似，紅肉火龍果種子只有在一定的秋水仙素濃度范圍內(nèi)處理才能誘導(dǎo)多倍體發(fā)生，低濃度較長(zhǎng)時(shí)間（如0.05%、0.1%秋水仙素浸種12～72 h或0.01%秋水仙素露白處理）或者高濃度短時(shí)間（如0.2%、0.3%秋水仙素浸種24 h）處理時(shí)，種子發(fā)芽率、存活率并未顯著降低；高濃度、長(zhǎng)時(shí)間處理則抑制了火龍果種子的萌發(fā)、生長(zhǎng)，浸種濃度和時(shí)間存在累積作用，表明存在明顯的劑量-時(shí)間互作關(guān)系［12，15，20］。另外，露白種子吸水漲破種皮，種胚失去種皮保護(hù)，秋水仙素溶液可短時(shí)間直接滲入到種胚［19］，因此，0.01%、0.05%的秋水仙素處理火龍果露白種子48 h就使幼苗存活率顯著降低，0.01% 24 h、0.05% 12 h均對(duì)幼苗生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯抑制作用。進(jìn)一步比較相同濃度秋水仙素處理相同時(shí)間的效應(yīng)，可見(jiàn)露白種子對(duì)秋水仙素的作用更敏感。無(wú)論是浸種處理還是露白處理，秋水仙素對(duì)紅肉火龍果幼苗生長(zhǎng)的抑制作用最明顯。

本試驗(yàn)中，秋水仙素浸種處理和露白處理分別可獲得0.2%～4.2%和0.2%～15.8%的疑似植株變異率，而且幼苗出現(xiàn)一些形態(tài)上的變異。綜合考慮紅肉火龍果種子發(fā)芽率、幼苗存活率、苗長(zhǎng)及植株變異率，以0.2%、0.3%秋水仙素浸種24～48 h或0.2%秋水仙素露白處理12～24 h誘變多倍體為宜。當(dāng)然，對(duì)秋水仙素誘導(dǎo)獲得的外觀形態(tài)疑似變異火龍果植株，還需進(jìn)一步開(kāi)展植株氣孔性狀、染色體計(jì)數(shù)、核DNA相對(duì)含量等的倍性鑒定。