陳瑞祥，葛文雪，秦云賀，王洪海，張雪蓮

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

結(jié)核病是危害人類健康的重要傳染病之一。2015年世界范圍內(nèi)新發(fā)結(jié)核病病例估計(jì)有 1 040 萬(wàn)，其中死亡140萬(wàn)，耐藥結(jié)核病新發(fā)病例約48萬(wàn)[1]。有效的藥物治療是防治結(jié)核病的關(guān)鍵，如利福平、異煙肼、吡嗪酰胺等一線藥物聯(lián)合使用的直接督導(dǎo)下短程化療(directly observed treatment short course，DOTS)方案，使人類在與結(jié)核病抗?fàn)幹腥〉昧藭簳r(shí)性勝利。然而，耐多藥結(jié)核(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)、廣泛耐藥結(jié)核(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)及利福平耐藥結(jié)核(rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB)的大量出現(xiàn)，表明研發(fā)具有新作用機(jī)制的抗結(jié)核藥物仍很迫切。

貝塔喹啉(TMC-207)是一個(gè)具有良好抗結(jié)核活性的新藥，通過(guò)抑制結(jié)核分枝桿菌的ATP合成酶而發(fā)揮活性[2-4]，全新的作用靶標(biāo)及良好的抗結(jié)核活性使其成為抗耐藥結(jié)核的希望。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)容量為5萬(wàn)個(gè)小分子化合物的化合物庫(kù)進(jìn)行了抗結(jié)核活性初步篩選，并對(duì)具有抗結(jié)核活性的小分子化合物進(jìn)行了系列優(yōu)化改造，最終獲得數(shù)十個(gè)具有抗耐藥結(jié)核活性的新型小分子化合物[5]。HY-152E是其中一個(gè)具有良好抗結(jié)核活性的化合物(MIC≤0.09 μg/mL)[6]，為進(jìn)一步研究其抗結(jié)核機(jī)制，本研究擬對(duì)其作用靶標(biāo)進(jìn)行分析。

目前，藥物作用靶蛋白的研究方法包括蛋白質(zhì)芯片(protein chip)測(cè)定[7]、藥物親和反應(yīng)靶點(diǎn)穩(wěn)定性(drug affinity responsive target stability，DARTS)檢測(cè)[8]、基于氧化速率的蛋白穩(wěn)定性(stability of proteins from rates of oxidation，SPROX)檢測(cè)[9]、熱力學(xué)蛋白質(zhì)組分析(thermal proteome profiling，TPP)[10]等技術(shù)。其中DARTS技術(shù)利用結(jié)合藥物分子后的靶蛋白對(duì)鏈霉菌蛋白酶的穩(wěn)定性相對(duì)提高而抵抗鏈霉菌蛋白酶消化的原理，篩選可能與藥物分子結(jié)合的潛在靶標(biāo)分子(圖1)。其不需對(duì)藥物分子進(jìn)行修飾，且系統(tǒng)中蛋白保有天然活性，是近年來(lái)較好的一種研究藥物靶標(biāo)的方法。本文即采用DARTS技術(shù)并結(jié)合蛋白質(zhì)譜學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)方法來(lái)探索分析活性化合物HY-152E可能的抗結(jié)核靶標(biāo)分子。

圖1藥物親和反應(yīng)靶點(diǎn)穩(wěn)定性的作用原理
Fig.1Theprincipleofdrugaffinityresponsivetargetstability(DARTS)assay

1 材料與方法

1.1 材料及重要試劑

化合物HY-152E委托上海皓元化學(xué)科技有限公司合成，溶解于二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中。Middlebrook 7H9和7H10為BD公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量試劑盒為北京艾德萊生物科技有限公司產(chǎn)品；蛋白酶抑制劑購(gòu)自Roche Diagnostics公司，取cOmpleteTMMini一片，用500 μL無(wú)菌水溶解配制為10 mg/mL的溶液，-20 ℃保存；鏈霉菌蛋白酶為Roche Diagnostics產(chǎn)品，用TNC溶液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、50 mmol/L NaCl、10 mmol/L CaCl2)溶解，母液濃度為10 mg/mL，-20 ℃保存，使用時(shí)按所需濃度進(jìn)行稀釋。其他試劑均為實(shí)驗(yàn)室常用分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1菌株及培養(yǎng)H37Ra菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存，用接種環(huán)劃線接種于7H10-10% ADC中，37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2～3周，再用接種環(huán)刮取菌落至滅菌的EP管中，-30 ℃ 保存待用。

1.2.2H37Ra裂解液的制備細(xì)菌裂解液體系：0.4% Triton X-100、400 mmol/L NaCl、100 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)和20%甘油。將300 μL細(xì)菌裂解液加入收集的菌體中，為防止破壁不充分，輕輕吹打至無(wú)結(jié)塊菌體；加入200～300 μL玻璃砂、150 μL磷酸酶抑制劑(40 mmol/L Na4P2O7、200 mmol/L NaF、0.4 mmol/L Na3VO4，-20 ℃ 保存)、30 μL蛋白酶抑制劑，補(bǔ)無(wú)菌水至總體積為600 μL；用FastPrep 24勻漿機(jī)破碎1 min(速率 6 m/s，45 s/次)，冰上放置1 min，循環(huán)12～14次；4 ℃ 13 000～15 000 r/min 充分離心10～15 min，確保上清液中無(wú)玻璃砂或蛋白沉淀物，收集上清液于冰上備用。用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)上清液總蛋白進(jìn)行定量(按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行)。

1.2.3不同濃度HY-152E的親和反應(yīng)靶點(diǎn)穩(wěn)定性檢測(cè)將細(xì)菌蛋白裂解液樣品用去離子水稀釋至濃度為4～6 μg/μL，分裝于1.5 mL EP管中，每管50 μL。每管加入不同濃度HY-152E(終濃度分別為0.6、1.2、3.0、4.8、6.0、9.0 mg/mL)，陰性對(duì)照為DMSO。輕輕顛倒混勻，避免劇烈操作影響蛋白的活性結(jié)構(gòu)，室溫孵育1 h。加入鏈霉菌蛋白酶 1.25 μg，輕輕混勻，室溫消化45 min，加入上樣緩沖液，沸水煮10 min終止酶切反應(yīng)，進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)。比較HY-152E組與對(duì)照組SDS-PAGE結(jié)果，尋找差異蛋白條帶。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，尋找重復(fù)性高的差異條帶。

1.2.4鏈霉菌蛋白酶的濃度及作用時(shí)間對(duì)親和反應(yīng)靶點(diǎn)穩(wěn)定性的影響選擇終濃度為9.0 mg/mL的 HY-152E，與菌體蛋白(250 μg)室溫孵育1 h。加入不同濃度的鏈霉菌蛋白酶(含量分別為 2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.25 μg)，使最終鏈霉菌蛋白酶(μg)∶菌體蛋白(μg)為1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 000。輕輕混勻，分別于室溫消化30、45、60 min，加入SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水煮 10 min 終止反應(yīng)，進(jìn)行12% SDS-PAGE。比較不同鏈霉菌蛋白酶濃度、不同水解時(shí)間下HY-152E組與DMSO對(duì)照組的SDS-PAGE結(jié)果，尋找差異蛋白條帶。

1.2.5差異條帶質(zhì)譜分析將蛋白水解后SDS-PAGE顯示重復(fù)性高的差異蛋白進(jìn)行切膠回收，用超高壓納升液相-高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析，比較分析蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果中HY-152E組與陰性對(duì)照組的差異多肽片段。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度HY-152E親和反應(yīng)靶點(diǎn)穩(wěn)定性的檢測(cè)

選擇不同濃度的HY-152E(終濃度分別為 0.6、1.2、3.0、4.8、6.0、9.0 mg/mL)及DMSO，與結(jié)核分枝桿菌菌體蛋白孵育。在鏈霉菌蛋白酶作用濃度為1∶200(1.25 μg)時(shí)，室溫消化45 min后電泳結(jié)果(圖2)顯示，在HY-152E作用下， 相對(duì)分子質(zhì)量 70 000 左右及 40 000～55 000 處分別有一條明顯的差異蛋白。在HY-152E作用下，差異蛋白條帶更清晰，且隨著濃度降低，蛋白條帶變?nèi)?，而DMSO對(duì)照組中蛋白條帶完全被水解，表明HY-152E可與該差異蛋白結(jié)合并保護(hù)蛋白耐受鏈霉菌蛋白酶的作用。

Lanes 1-7 corresponding to the final concentrations of compound HY-152E: 9.0,6.0,4.8,3.0,1.2,0.6 mg/mL.Hydrolysis time: 45 min; streptomycin protease concentration: 1∶200 (1.25 μg).Lane 8: DMSO control without compound HY-152E.

圖2DARTS檢測(cè)HY-152E與結(jié)核分枝桿菌菌體蛋白結(jié)合
Fig.2DARTSexperimentforanalysisofcompoundHY-152EbindingtoproteintargetsofMycobacteriumtuberculosis

2.2 鏈霉菌蛋白酶濃度及作用時(shí)間對(duì)親和反應(yīng)靶點(diǎn)穩(wěn)定性的影響

為確定HY-152E對(duì)上述差異蛋白耐鏈霉菌蛋白酶保護(hù)作用的真實(shí)性，進(jìn)一步分析不同濃度鏈霉菌蛋白酶及不同水解時(shí)間對(duì)HY-152E與蛋白結(jié)合并保護(hù)差異蛋白耐受鏈霉菌蛋白酶作用的影響。同時(shí)，為使目標(biāo)差異條帶更清晰，將10%蛋白膠濃度(1.2.3)改為12%(1.2.4)。圖3顯示了菌體蛋白與終濃度為 9.0 mg/mL的HY-152E互作后，在不同濃度鏈霉菌蛋白酶作用下分別水解30、45和60 min的結(jié)果。與圖1結(jié)果相同，在相對(duì)分子質(zhì)量 70 000 左右和 45 000～55 000 處分別有一條明顯的差異條帶，且隨著鏈霉菌蛋白酶濃度變化，差異條帶呈現(xiàn)明顯的濃度梯度差異。作用時(shí)間相同時(shí)，隨著鏈霉菌蛋白酶濃度降低，蛋白水解程度也降低；鏈霉菌蛋白酶被稀釋至1∶400時(shí)，水解程度已不明顯(圖3B及3C第3泳道)。鏈霉菌蛋白酶濃度相同時(shí)，隨著水解時(shí)間增加，靶蛋白消化程度加深(圖3A、3B及3C第4泳道)，但60 min時(shí)靶蛋白經(jīng)HY-152E穩(wěn)定后消化程度基本不再變化?；贒ARTS作用原理，蛋白-分子耦合物的穩(wěn)定性比單獨(dú)蛋白高，可抵抗蛋白酶的消化作用。上述結(jié)果推測(cè)，具有抗結(jié)核活性的HY-152E可能是與差異蛋白結(jié)合，從而保護(hù)差異蛋白耐受鏈霉菌蛋白酶的水解作用。

The final concentration of compound HY-152E is 9.0 mg/mL.Lanes 1-5 corresponding to streptomycin protease concentrations of 1∶1 000,1∶800,1∶400,1∶200,1∶100; no streptomycin protease in lane 6.Hydrolysis time: 30 min in A,45 min in B,60 min in C.

圖3鏈霉菌蛋白酶濃度及作用時(shí)間對(duì)親和反應(yīng)靶點(diǎn)穩(wěn)定性的影響
Fig.3EffectsofconcentrationanddigestiontimeofstreptomycinproteaseonDARTSresults

2.3 蛋白質(zhì)譜結(jié)果分析

比較HY-152E組與DMSO對(duì)照組的SDS-PAGE差異蛋白，將相同位置的膠切割回收。DARTS技術(shù)原理表明，相比于可結(jié)合蛋白，如果蛋白無(wú)法與小分子結(jié)合，其穩(wěn)定性低，水解過(guò)程中會(huì)發(fā)生降解。因此，通過(guò)比較蛋白質(zhì)譜的數(shù)據(jù)，去除HY-152E組和對(duì)照組中共有的多肽片段，保留只在HY-152E組出現(xiàn)的肽段信息，并根據(jù)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量篩選 70 000 左右及 45 000～55 000 處的蛋白。質(zhì)譜數(shù)據(jù)來(lái)源于兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)樣品，通過(guò)UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，顯示 70 000 左右的蛋白共計(jì)52個(gè)，45 000～55 000 處的蛋白共計(jì)34個(gè)。

結(jié)合兩次蛋白質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果，利用TB Database基因數(shù)據(jù)庫(kù)，分析對(duì)應(yīng)蛋白的編碼基因在結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)中的必需性及基因生理功能信息，并結(jié)合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量、蛋白肽段可信度的綜合評(píng)分，篩選出9個(gè)可能是HY-152E抗結(jié)核作用的潛在靶蛋白(表1)，供后續(xù)進(jìn)一步研究。

表1化合物HY-152E的可能靶蛋白
Tab.1PossibletargetproteinsforcompoundHY-152E

Molecularweight(×1000)GeneProtein109．0705glnEGlutamate?ammonia ligaseadenylyltransferase98．4116polADNApolymeraseI96．8561dnaBReplicativeDNAhelicase71．4614glfTGalactofuranosyltransferaseGlfT253．4182gltDGlutamatesynthase[NADPH] smallchain50．3608lgtProlipoprotein diacylglyceryltransferase46．7534clpXATP?dependentClpproteaseATP? bindingsubunit46．2739hisDHistidinoldehydrogenase44．0355murAUDP?N?acetylglucosamine 1?carboxyvinyl?transferase

3 討論

藥物靶標(biāo)的確定是篩選藥物的基礎(chǔ)，新的藥物靶標(biāo)有助于篩選出結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制全新的藥物，因而尋找切實(shí)可靠的藥物靶標(biāo)一直是藥物研究的關(guān)鍵，而基于活性藥物或化合物篩選的藥物靶標(biāo)具有切實(shí)的可靠性。本研究在前期篩選的具有良好抗結(jié)核活性化合物的基礎(chǔ)上開展藥物靶標(biāo)研究，對(duì)篩選新型抗結(jié)核藥物和藥物靶標(biāo)具有重要價(jià)值。

98%以上的藥物靶標(biāo)屬于蛋白。從理論上說(shuō)，作為藥物靶標(biāo)的蛋白必須能以適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)特性和親和力結(jié)合小分子化合物[11]。近年來(lái)，大量分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，尤其是基因組學(xué)、生物信息學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及生物大分子相互作用分析(biospecific interaction analysis，BIA)等推動(dòng)了從紛繁復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)生物大分子中發(fā)現(xiàn)特異性藥物作用靶標(biāo)分子的進(jìn)程[12]。靶標(biāo)的尋找通常在基因數(shù)據(jù)庫(kù)、轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平進(jìn)行。Lomenick等[8]提出的DARTS技術(shù)是在蛋白水平開展的靶標(biāo)研究，不僅能避免因標(biāo)記或修飾導(dǎo)致小分子喪失活性的問題，保持蛋白的天然活性，還能避免基因數(shù)據(jù)庫(kù)大量信息處理過(guò)程，比較簡(jiǎn)單易行。

本研究采用未進(jìn)行分子修飾的DARTS技術(shù)確定靶標(biāo)，研究的蛋白來(lái)自結(jié)核分枝桿菌總蛋白。查閱已發(fā)表的文獻(xiàn)資料發(fā)現(xiàn)，利用DARTS技術(shù)篩選藥物作用靶標(biāo)的對(duì)象全部為真核細(xì)胞[13-17]。因此，本研究以原核生物為研究對(duì)象，尤其是對(duì)細(xì)胞壁和脂質(zhì)層較厚的結(jié)核分枝桿菌而言，菌體蛋白的前期處理及蛋白使用濃度是較重要的環(huán)節(jié)。DARTS實(shí)驗(yàn)中蛋白濃度要求為4～6 μg/μL[8]，蛋白濃度太低或太高均影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，且蛋白濃度不準(zhǔn)確不利于尋找差異蛋白條帶。經(jīng)摸索，本研究按3～4環(huán)(刮菌環(huán))菌量，用300 μL Triton X-100細(xì)胞裂解液提取相應(yīng)蛋白，所得蛋白濃度基本符合要求。DARTS實(shí)驗(yàn)所用裂解液必須新鮮，需避免劇烈振搖，以免引起蛋白變性，進(jìn)而影響其與藥物的結(jié)合，而HY-152E溶解于DMSO。因此，為防止DMSO在低溫下凝結(jié)，室溫下進(jìn)行化合物與菌體蛋白孵育有助于實(shí)驗(yàn)的良好重復(fù)性。本研究發(fā)現(xiàn)，HY-152E的最佳濃度>6.0 μg/μL，鏈霉菌蛋白酶的最佳用量為蛋白酶∶菌體蛋白=1∶100或1∶200，鏈霉菌蛋白酶水解時(shí)間要控制在45～60 min。此外，在菌體蛋白處理過(guò)程中使用了磷酸酶和蛋白酶抑制劑，這兩種抑制劑對(duì)鏈霉菌蛋白酶(來(lái)源于灰色鏈霉菌)的消化功能無(wú)明顯影響[8]。

HY-152E潛在靶標(biāo)蛋白在結(jié)核分枝桿菌的生理功能方面發(fā)揮重要作用。如ClpX為Clp蛋白酶ATP結(jié)合亞基部分，參與結(jié)核分枝桿菌蛋白的正確折疊、降解錯(cuò)誤蛋白等[18-19]；DnaB 和 PolA 分別是DNA復(fù)制過(guò)程中的解旋酶和DNA聚合酶Ⅰ，控制細(xì)菌DNA的解旋和染色體的起始及延伸，是細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的關(guān)鍵[20-21]；與肽聚糖生物合成相關(guān)的UDP-N-乙酰葡糖胺-羧基乙烯基轉(zhuǎn)移酶(MurA)及組氨酸生物合成途徑關(guān)鍵酶——組氨醇脫氫酶(HisD)均為結(jié)核分枝桿菌物質(zhì)合成代謝的關(guān)鍵蛋白[22-23]。Gene Ontology分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要富集于結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁和胞質(zhì)中。目前，很多化合物對(duì)結(jié)核分枝桿菌的弱殺菌或無(wú)殺菌活性緣其很難透過(guò)結(jié)核分枝桿菌較厚的細(xì)胞壁，而本研究中篩選的HY-152E潛在靶蛋白主要集中于細(xì)胞壁，這對(duì)篩選具有良好活性的抗結(jié)核新藥的研究具有十分重要的意義。

本研究中，僅以DARTS技術(shù)通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)的差異肽段來(lái)確定潛在靶標(biāo)存在一定的局限性，未能實(shí)現(xiàn)定量比較。這主要是由于結(jié)核分枝桿菌在培養(yǎng)過(guò)程中沒有采用標(biāo)記培養(yǎng)基，如果能利用SILAC或穩(wěn)定同位素標(biāo)記培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)菌，后續(xù)只需分別將等量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的蛋白混合進(jìn)行DARTS技術(shù)處理，從而在蛋白質(zhì)譜分析時(shí)可較準(zhǔn)確地對(duì)差異蛋白進(jìn)行定量分析。因此，本研究確定的9個(gè)潛在的HY-152E作用靶標(biāo)還需進(jìn)一步在體外靶向結(jié)合能力及靶蛋白生物功能影響方面進(jìn)行深入驗(yàn)證。

[1] WHO.Global tuberculosis report 2016 [R/OL].http://www.who.int/tb/publications/global_report/archive/en.

[2] Andries K,Verhasselt P,Guillemont J,G?hlmann HW,Neefs JM,Winkler H,Van Gestel J,Timmerman P,Zhu M,Lee E,Williams P,de Chaffoy D,Huitric E,Hoffner S,Cambau E,Truffot-Pernot C,Lounis N,Jarlier V.A diarylquinoline drug active on the ATP synthase of Mycobacterium tuberculosis [J].Science,2005,307(5707): 223-227.

[3] Diacon AH,Pym A,Grobusch M,Patientia R,Rustomjee R,Page-Shipp L,Pistorius C,Krause R,Bogoshi M,Churchyard G,Venter A,Allen J,Palomino JC,De Marez T,van Heeswijk RP,Lounis N,Meyvisch P,Verbeeck J,Parys W,de Beule K,Andries K,Mc Neeley DF.The diarylquinoline TMC207 for multidrug-resistant tuberculosis [J].N Engl J Med,2009,360(23): 2397-2405.

[4] Huitric E,Verhasselt P,Koul A,Andries K,Hoffner S,Andersson DI.Rates and mechanisms of resistance development in Mycobacterium tuberculosis to a novel diarylquinoline ATP synthase inhibitor [J].Antimicrob Agents Chemother,2010,54(3): 1022-1028.

[5] Luo R,Laitinen T,Teng L,Nevalainen T,Lahtela-Kakkonen M,Zheng B,Wang H,Poso A,Zhang X.Synthesis and biological evaluation of arylthiourea derivatives with antitubercular activity [J].Lett Drug Des Discov,2013,10(7): 640-650.

[6] 滕麗艷，劉霞，張雪蓮，王洪海．新型先導(dǎo)化合物E體外抗結(jié)核分枝桿菌活性的研究 [J]．微生物與感染，2012，7(4)：208-212．

[7] Parasido EM,Silvestri A,Canzonieri V,Belluco C,Diodoro MG,Milione M,Melotti F,De Maria R,Liotta L,Petricoin EF,Pierobon M.Protein drug target activation homogeneity in the face of intra-tumor heterogeneity: implications for precision medicine [J].Oncotarget,2017,8(30): 48534-48544.

[8] Lomenick B,Hao R,Jonai N,Chin RM,Aghajan M,Warburton S,Wang J,Wu RP,Gomez F,Loo JA,Wohlschlegel JA,Vondriska TM,Pelletier J,Herschman HR,Clardy J,Clarke CF,Huang J.Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS) [J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(51): 21984-21989.

[9] Strickland EC,Geer MA,Tran DT,Adhikari J,West GM,Dearmond PD,Xu Y,Fitzgerald MC.Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation [J].Nat Protoc,2013,8(1): 148-161.

[10] Franken H,Mathieson T,Childs D,Sweetman GM,Werner T,T?gel I,Doce C,Gade S,Bantscheff M,Drewes G,Reinhard FB,Huber W,Savitski MM.Thermal proteome profiling for unbiased identification of direct and indirect drug targets using multiplexed quantitative mass spectrometry [J].Nat Protoc,2015,10(10): 1567-1593.

[11] 周喆，王升啟．藥物靶標(biāo)搜尋和驗(yàn)證方法的研究進(jìn)展 [J]．國(guó)外醫(yī)學(xué):藥學(xué)分冊(cè)，2005，32(3)：145-149．

[12] 楊建雄，劉志輝．藥物靶標(biāo)在新藥研發(fā)中的作用 [J]．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20(3)：750-751．

[13] Gotsbacher MP,Cho S,Kwon HJ,Karuso P.Daptomycin,a last-resort antibiotic,binds ribosomal protein S19 in humans [J].Proteome Sci,2017,15: 16.doi:10.1186/s12953-017-0124-2.

[14] Kim D,Hwang HY,Kim JY,Lee JY,Yoo JS,Marko-Varga G,Kwon HJ.FK506,an immunosuppressive drug,induces autophagy by binding to the V-ATPase catalytic subunit A in neuronal cells [J].J Proteome Res,2017,16(1): 55-64.

[15] Kost GC,Yang MY,Li L,Zhang Y,Liu CY,Kim DJ,Ahn CH,Lee YB,Liu ZR.A novel anti-cancer agent,1-(3,5-dimethoxyphenyl)-4-[(6-fluoro-2-methoxyquinoxalin-3-yl)aminocarbonyl] piperazine (RX-5902),interferes with β-catenin function through Y593 phospho-p68 RNA helicase [J].J Cell Biochem,2015,116(8): 1595-1601.

[16] Park YD,Sun W,Salas A,Antia A,Carvajal C,Wang A,Xu X,Meng Z,Zhou M,Tawa GJ,Dehdashti J,Zheng W,Henderson CM,Zelazny AM,Williamson PR.Identification of multiple cryptococcal fungicidal drug targets by combined gene dosing and drug affinity responsive target stability screening [J].MBio,2016,7(4): e01073-16.doi: 10.1128/mBio.01073-16.

[17] Qu Y,Gharbi N,Yuan X,Olsen JR,Blicher P,Dalhus B,Brokstad KA,Lin B,?yan AM,Zhang W,Kalland KH,Ke X.Axitinib blocks Wnt/β-catenin signaling and directs asymmetric cell division in cancer [J].Proc Natl Acad Sci USA,2016,113(33): 9339-9344.

[18] Ingvarsson H,Maté MJ,H?gbom M,Portno? D,Benaroudj N,Alzari PM,Ortiz-Lombardía M,Unge T.Insights into the inter-ring plasticity of caseinolytic proteases from the X-ray structure of Mycobacterium tuberculosis ClpP1 [J].Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2007,63(Pt 2): 249-259.

[19] Sherrid AM,Rustad TR,Cangelosi GA,Sherman DR.Characterization of a Clp protease gene regulator and the reaeration response in Mycobacterium tuberculosis [J].PLoS One,2010,5(7): e11622.

[20] Xie Y,He ZG.Characterization of physical interaction between replication initiator protein DnaA and replicative helicase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv [J].Biochemistry (Mosc),2009,74(12): 1320-1327.

[21] Arrigo CJ,Singh K,Modak MJ.DNA polymerase I of Mycobacterium tuberculosis: functional role of a conserved aspartate in the hinge joining the M and N helices [J].J Biol Chem,2002,277(3): 1653-1661.

[22] Babajan B,Chaitanya M,Rajsekhar C,Gowsia D,Madhusudhana P,Naveen M,Chitta SK,Anuradha CM.Comprehensive structural and functional characterization of Mycobacterium tuberculosis UDP-NAG enolpyruvyl transferase (Mtb-MurA) and prediction of its accurate binding affinities with inhibitors [J].Interdiscip Sci,2011,3(3): 204-216.

[23] Lunardi J,Martinelli LKB,Raupp AS,Nunes JES,Rostirolla DC,Timmers LFSM,Villela AD,Pissinate K,Limberger J,de Souza ON,Basso LA,Santos DS,Machado P.Mycobacterium tuberculosis histidinol dehydrogenase: biochemical characterization and inhibition studies [J].RSC Adv,2016,6(34): 28406-28418.