李天柱，崔鳳姬，王文濤，李宏，由豐銘，于淼，董雪琦，翟云鵬，王敏

（1．赤峰學(xué)院 醫(yī)學(xué)院；2．赤峰生殖健康?？漆t(yī)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

肝癌是惡性程度和復(fù)發(fā)率高、易轉(zhuǎn)移的腫瘤之一[1].傳統(tǒng)的外科手術(shù)、化療或放療等治療手段都有局限性，生存率仍無(wú)改善.近年來(lái)，盡管在肝癌的診斷和治療上有較大的進(jìn)展，但對(duì)于肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲機(jī)制仍未闡明，術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是影響治療效果的重要因素之一[2].因此，肝癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的研究有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值.

翻白草是一種薔薇科植物，在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥典籍和其他國(guó)家的民間都被廣泛地應(yīng)用.好多人對(duì)翻白草的化學(xué)成分、毒理和病理等生理等基礎(chǔ)研究和對(duì)翻白草的藥用、食用和生產(chǎn)化工原料等的應(yīng)用研究付出了努力[3].

2011年，李忠秀等人分別研究發(fā)現(xiàn)翻白草油具有抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的功能，可能是一種新型的抗腫瘤藥物[4].但未見(jiàn)關(guān)于翻白草油對(duì)于肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲能力的報(bào)道.通過(guò)本研究闡明翻白草油對(duì)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲有影響，為肝癌的治療方案尋求新的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人肝癌細(xì)胞HepG2（中科院上海細(xì)胞庫(kù)）.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco公司）；TranswellTM 小室（Becton Dickinson Labware公司）.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度.

1.2.2 藥物配制：用DMEM培養(yǎng)液將翻白草油（DMSO溶解）稀釋成濃度10mg/mL儲(chǔ)備液，4℃保存?zhèn)溆?

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組：翻白草油組（用DMSO稀釋后，以DMEM培養(yǎng)液稀釋成0.5mg/mL），另設(shè)對(duì)照組（僅加DMEM培養(yǎng)液）.

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力：先把細(xì)胞重懸，各組細(xì)胞接種于24孔板，然后將細(xì)胞鋪滿后利用小槍頭在24孔板中央畫(huà)一條線，加入0.5mg/mL翻白草油，0h和48h觀察并拍照，利用Image J測(cè)細(xì)胞遷移的距離，各取隨機(jī)的5組計(jì)數(shù).重復(fù)3次實(shí)驗(yàn).

1.2.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力：先把細(xì)胞重懸，上室加1×105細(xì)胞，然后在下室加DMEM完全培養(yǎng)液，48h后棄掉上下室的培養(yǎng)基，利用棉簽擦拭上室的細(xì)胞.利用10%甲醛把細(xì)胞固定,用蘇木精染色,用刀片將把小室膜切下，利用倒置顯微鏡分別計(jì)數(shù)5個(gè)視野穿模的細(xì)胞平均數(shù).重復(fù)3次實(shí)驗(yàn).

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)利用Sigma Plot 2000軟件進(jìn)行分析，數(shù)值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，利用t檢驗(yàn)檢測(cè)顯著性分析.

2 結(jié)果

2.1 翻白草油抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的遷移能力

翻白草油組細(xì)胞劃痕48h后遷移距離為（39±4.2）μm，對(duì)照組（221±6.8）μm.翻白草油組細(xì)胞遷移距離明顯比對(duì)照組短(P＜0.05)（圖1）.

圖1 劃痕實(shí)驗(yàn)48h后各組細(xì)胞的遷移情況(×100)

2.2 翻白草油抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的侵襲能力

翻白草油組細(xì)胞侵襲48h后穿透小孔板的細(xì)胞數(shù)為（11±1）個(gè)，對(duì)照組（60±5）個(gè).翻白草油組穿過(guò)小孔的細(xì)胞數(shù)明顯比對(duì)照組少(P＜0.05)（圖2）.

圖2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞48h穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)(×200)

3 討論

肝癌是中國(guó)癌癥患者死亡的原因之一，高度的血管浸潤(rùn)以及侵襲轉(zhuǎn)移導(dǎo)致了預(yù)后不良的現(xiàn)象.目前,對(duì)抗腫癌藥物研究從細(xì)胞毒型藥物向癌癥治病基因的拮抗劑的發(fā)展.因?yàn)橹胁菟幍亩靖弊饔幂^小,所以從中藥中尋找抗癌天然化合物引起了國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者的高度重視.翻白草性味苦,平，功能主治祛風(fēng)濕、解毒、痢疾和風(fēng)濕筋骨疼痛等疾病[5].

研究表明翻白草油可抑制人肝癌細(xì)系HepG2的細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的功能[4].但目前，未見(jiàn)關(guān)于翻白草油對(duì)于肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲能力的報(bào)道.肝癌患者的主要死亡原因是肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，也是導(dǎo)致治療預(yù)后不良，易復(fù)發(fā)的原因.

通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)翻白草油能明顯抑制HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲.說(shuō)明翻白草油對(duì)調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲起著重要的作用.從而推測(cè)翻白草對(duì)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲有影響，為肝癌的治療提供新的理論依據(jù).

〔1〕Hernandez-Gea V，Toffanin S，F(xiàn)riedman SL，et al．Role ofthe microenvironmentin the pathogenesis and treatment ofhepatocellular carcinoma[J]．Gastroenterology，2013，144：512-527．

〔2〕Zhang L，Yang J，Chen XQ，et al．Antidiabetic and antioxidant effects of extracts from Potentilla discolor Bunge on diabetic rats induced by high fat diet and streptozotocin [J]．J Ethnopharmacol，2010，132：518-524．

〔3〕Subbotina MD，Timchenko VN，Vorobyov MM，et al．Effect of oral administration of tormentil root extract (Potentilla tormentilla)on rotavirus diarrhea in children：arandomized,double blind,controlled trial[J]．Pediatr Infect Dis J．2003，22：706-711．

〔4〕李忠秀，王淑秋，劉蕾，等．翻白草油對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞CDK4蛋白的影響[J]．黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2011（34）：25-26．

〔5〕Yoon WJ，Moon JY，Kang JY，et al．Neolitsea sericea essential oil attenuates LPS-induced inflammationinRAW 264．7macrophagesby suppressing NF-kappaB and MAPK activation[J]．Nat Prod Commun．2010,5(8)：1311-1316．